Rekombinant kollagen I peptid Microcarriers for celleutvidelse og deres mulige bruk som cellen levering System i en Bioreactor modellen
Summary
Vi foreslår en celle ekspansjon protokoll på macroporous microcarriers og deres bruk som levering system i en perfusjonsmåling bioreactor å frø en decellularized vev matrise. Vi har også forskjellige teknikker for å finne celle spredning og levedyktigheten til celler kultivert på microcarriers. Videre viser vi funksjonaliteten til cellene etter bioreactor kulturer.
Abstract
Tissue engineering er et lovende felt, fokusert på å utvikle løsninger for den økende etterspørselen på vev og organer om transplantasjon formål. Prosessen for å generere slike vev er kompleks, og inkluderer en passende kombinasjon av spesifikke celletyper, stillaser og fysisk eller biokjemiske stimuli å veilede cellevekst og differensiering. Microcarriers representerer et tiltalende for å utvide celler i en tredimensjonal (3D) microenvironment, siden de gir høyere overflate-til volum prosenter og etterligne nærmere i vivo situasjonen sammenlignet med tradisjonelle todimensjonal metoder. Karsystemet, oksygen og næringsstoffer til cellene og sikre fjerning, utgjør en viktig byggesten når genererer konstruert vev. Faktisk mislykkes de fleste konstruksjoner etter blir implantert på grunn av manglende vaskulær støtte. Vi presenterer en protokoll for endothelial celle ekspansjon på rekombinant kollagen-baserte microcarriers under dynamiske forhold i spinner kolbe og bioreaktorer i denne studien, og vi forklare hvordan du finner i denne innstillingen celle levedyktighet og funksjonalitet. Dessuten, foreslår vi en metode for cellen levering for endometrial blodkar formål uten ytterligere avdeling trinnene som er nødvendig. Videre yter vi en strategi for å evaluere den cellen endometrial blodkar potensielle i en perfusjonsmåling bioreactor på et decellularized biologisk matrise. Vi mener at bruken av metodene presentert kan føre til utvikling av nye cellen-basert behandling for et stort utvalg av vev utvikling programmer i klinisk praksis.
Introduction
Et generelt problem i vev engineering programmer er å gi en høy cellemasse med riktig differensiering fenotypen der trenger. Bruk av microcarriers for å løse dette problemet startet i 1967 med økende betydning langt i felt som ortopediske tissue engineering for store generasjon av hud, bein, brusk og sener1. De tillater håndtering av tilhenger kulturer på måter ligner på suspensjon kulturer2 utvide celler i Mikroskala tredimensjonale (3D) underlag. Dermed oppleve celler en homogen nærings levering og celle-matrix interaksjoner som fører til bedre vedlikehold av i vivo3,4 differensiering er ofte tapt over tid i 2D tilnærminger5. Høyere overflate-til-volum forholdet – til slutt fører til høyere celle gir6,7, høyere gass og næringsstoffer valutakurser sammenligne statisk systemer8, muligheten til å regulere og underlagt kulturen fysisk stimuli9og potensialet for å skalere opp av ekspansjon prosessen7 er ytterligere fordeler. Flere funksjoner som diameter, tetthet, porøsitet, overflate kostnad og vedheft egenskaper10,11 skille ulike kommersielt tilgjengelig mikro – og makro-bærere. Men er en av de viktigste fordelen deres leveringsmidler potensial som microtissues nettstedet defekt eller etterspørsel.
For programmer av microcarrier teknologi i bein vev engineering, vi illustrert i en tidligere rapport12 produksjon av en ny microcarrier type utgjorde av en rekombinant kollagen jeg peptid (RCP, kommersielt tilgjengelig som Cellnest). Denne nye microcarrier kan GMP-kompatibel opp skalering av stillaset og celle produksjon, behov for cellen levering i klinisk scenario. I denne sammenheng kan tuning av stillaset stabilitet, degradering rate og overflateegenskaper gjennom riktig valg av en egnet crosslinking strategi tilpasse teknikken til det valgte programmet, celle type interesse eller målrette vev13. Spesielt gjør potensielle ansettelse av dette microcarrier som en injeksjon celle levering system for terapeutisk program14 dem spesielt interessant i en klinisk setting.
I dette papiret illustrere vi derfor culturing prosedyren for isolasjon og utvidelse av menneskelig bein margtransplantasjon-avledet mesenchymal stromal celler (hBMSCs) og menneskelige dermal mikrovaskulær endotelceller (HDMECs) på kollagen-jeg-baserte rekombinant peptid-basert microcarriers og sine forberedelser for levering i en klinisk setting. I tillegg beskriver vi ytterligere protokoller nyttig for vedlikehold av cellen levedyktighet ved implantasjon.
Cellen levedyktighet etter implantasjon er sterkt avhengig av endometrial blodkar15,16,17, som sikrer utveksling av oksygen og næringsstoffer og forenkler fjerning. Bioreaktorer utgjør en tilnærming for å overvinne endometrial blodkar utfordringer i tissue engineering og vedlikeholde celle levedyktighet, gjennom perfusjon av kultur medium gir dermed oksygen og næringsstoffer18. Her viser vi en i vitro metode for å vurdere migrasjon muligheten av mikrovaskulær endotelceller fra RCP-microcarriers en biomatrix og deres evne til å bidra til de novo endometrial blodkar og angiogenese. Denne biomatrix er en decellularized del av svin jejunum kalt BioVaSc (biologiske Vascularized stillas), rik på kollagen og elastin og med bevart vaskulære strukturer, som inkluderer en fôring arterie og en drenering blodåre19 som er brukes for implantasjon problemer20.
Protocol
Representative Results
Discussion
En Hovedmålet med microcarrier er utvidelsen av celler mens deres differensiering for å levere celler til stedet trenger. Metoden representert introdusere RCP microcarriers der cellene kunne knytte sprer og kolonisere microcarriers med høyt tetthet. Dette ble observert av live/døde flekker, der mer enn 90% av levedyktige cellers ble oppdaget mens bare noen døde celler ble innhentet etter 7 dager med dynamisk kulturer. Likeledes, SEM bildene bekreftet at cellene dekket hele overflaten av microcarriers etter 7 dager a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen førte til disse resultatene har mottatt finansiering fra den europeiske Union syvende Framework program FP7/2007-2013 under grant avtalen n ° 607051 (BIO-INSPIRERE). Vi takker Carolien van Spreuwel-Goossens fra Fujifilm produksjon Europa B.V. for teknisk assistanse under RCP produksjon og Werner Stracke fra Fraunhofer Institute for Silicate forskning ISC, hjelp med SEM analyse.
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
References
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
- Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
- Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O’Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
- Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
- Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
- Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
- Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
- Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
- Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
- Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
- Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
- Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
- Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
- Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , (2002).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
- Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
- Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
- Plunkett, N., O’Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
- Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).
