Мы предлагаем протокол расширения клетки на Макропористые microcarriers и их использования в качестве системы доставки в биореакторе перфузии заполнить матрицу decellularized ткани. Мы также включать различные методы для определения клеточной пролиферации и жизнеспособность клеток, культивируемых на microcarriers. Кроме того мы демонстрируем функциональность клеток после биореактор культур.
Тканевая инженерия является многообещающей областью, сосредоточена на разработке решений для растущего спроса на относительно целей трансплантации органов и тканей. Процесс для создания таких тканей является сложным и включает соответствующую комбинацию типов конкретных клеток, подмости и физическое или биохимических стимулы для руководства клеточный рост и дифференциацию. Microcarriers представляют собой привлекательный инструмент для расширения клеток в трехмерное (3D) микроокружения, поскольку они обеспечивают более высокие поверхности для соотношения объема и более тесно имитировать ситуации в естественных условиях , по сравнению с традиционными методами двумерной. Сосудистой системы, поставку кислорода и питательных веществ к клеткам и обеспечения удаления отходов, является важным строительным блоком при генерации инженерии тканей. В самом деле большинство конструкций не после имплантированных ввиду отсутствия сосудистой поддержки. В этом исследовании мы представляем собой протокол для расширения эндотелиальных клеток на рекомбинантных коллагена основе microcarriers в динамических условиях в колбу спиннер и биореакторов, и мы объясним, как определить этот параметр жизнеспособность клеток и функциональности. Кроме того мы предлагаем метод для доставки клеток для целей васкуляризации без дополнительных отряд необходимые шаги. Кроме того мы предоставляем стратегию оценки клетки васкуляризации потенциал в биореакторе перфузии на матрицу decellularized биологических. Мы считаем, что использование представленных методов может привести к разработке новых методов лечения на основе ячеек для большого спектра тканей, инженерных приложений в клинической практике.
Одна общая проблема в инженерных приложениях ткани необходимо приносить высокий клеточной массы с фенотипом правильным дифференциация на месте. Применение microcarriers для решения этого вопроса началась в 1967 году с увеличением значение на сегодняшний день в таких областях, как ортопедические тканевой инженерии для крупномасштабных поколения кожи, костей, хрящей и сухожилий1. Они позволяют обработку адэрентных культур способами аналогична подвеска культур2 путем расширения клетки на микромасштабной трехмерные (3D) подложках. Таким образом клетки опыт однородной питательных и ячейки матрицы взаимодействий, что приводит к более эффективного обслуживания в естественных условияхдифференциации4 3,, который часто теряется во времени в 2D приближается к5. Более высокий коэффициент поверхности тома – в конечном итоге приводит к выше ячейке урожайность6,7, выше газа и питательных обменных курсов, сравнивая статических систем8, возможность регулировать и подлежащих физической культуры раздражители9и потенциал для дальнейшего развития процесса расширения7 далее являются преимущества. Некоторые функции, такие как диаметр, плотность, пористость, поверхности заряд и адгезии свойства10,11 различать различные коммерчески доступных микро – и макро перевозчиков. Однако одним из главных преимуществ является их поставка, потенциал как microtissues сайт дефекта или спроса.
Для применения microcarrier технологии в кости тканевой инженерии, мы показано в предыдущем докладе12 производства из новой microcarrier типа представляют собой рекомбинантные коллагена я пептида (RCP, коммерчески доступных как Cellnest). Этот новый microcarrier позволяет GMP-совместимый до масштабирование подмости и ячейки производства, необходимые для доставки клеток в клинической ситуации. В этом контексте тюнинг эшафот стабильности, степень деградации и свойств поверхности путем правильного выбора стратегии подходит сшивки позволяет адаптировать технику для выбранного приложения, ячейки тип интереса или целевой ткани13. В частности потенциал занятости этой microcarrier как инъекционные ячейки системы доставки для терапевтического применения14 делает их особенно интересными в клинических условиях.
В этой статье мы поэтому иллюстрируют культивирования процедура изоляции и расширение человеческих костного мозга-производные мезенхимальных стромальных клеток (hBMSCs) и человеческого кожного микрососудистой эндотелиальных клеток (HDMECs) на коллаген я-на основе рекомбинантной на основе пептида microcarriers и их подготовка для доставки в клинических условиях. Кроме того мы описываем дополнительные протоколы, полезных для поддержания жизнеспособности клеток после имплантации.
Жизнеспособность клеток после имплантации в действительности сильно зависит от васкуляризации15,16,,17, которая обеспечивает обмен кислорода и питательных веществ и облегчает удаление отходов. Биореакторов представляют собой один из подходов к преодолеть проблемы васкуляризации в тканевой инженерии и поддерживать жизнеспособность клеток, через перфузии питательной среды, тем самым обеспечивая18кислорода и питательных веществ. Здесь мы показываем в vitro метод для оценки возможности миграции микрососудистой эндотелиальных клеток от RCP microcarriers Биоматрикс и их способность вносить вклад в de novo васкуляризации и ангиогенеза. Этот Биоматрикс является сегмент decellularized свинину тощей кишки называется BioVaSc (биологические васкуляризированной леску), богатые коллагена и эластина и с сосудистых структур, которые включает в себя питание артерии и крылом вен19 , который был применяется для имплантации вопросы20.
Одна Главная цель microcarrier является расширение клеток при сохранении их дифференциации для того, чтобы доставить клетки место необходимости. Представленный метод ввести microcarriers RCP, где клетки смогли прикрепить, размножаться и колонизировать microcarriers с плотностью высокого клеток. Это было…
The authors have nothing to disclose.
Исследований, приведших к эти результаты получила финансирование от Европейского союза седьмой рамочной программы FP7/2007-2013 под Грант соглашение n ° 607051 (био-ВДОХНОВЛЯТЬ). Мы благодарим Кристина ван Spreuwel-Гуссенс от Fujifilm производства Europe B.V., для оказания технической помощи при производстве RCP и Вернер Страке из Института Фраунгофера силикатных исследования ISC, для помощи с SEM анализ.
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
Cellnest | Fujifilm | ||
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Peristaltic pump | Ismatec | ||
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |