Recombinante colágeno peptídeo Microcarriers para expansão da célula e seu potencial uso como sistema de entrega de células em um bioreator modelo
Summary
Propomos um protocolo de expansão celular na se microcarriers e seu uso como sistema de entrega em um bioreator de perfusão para propagar uma matriz de tecido decellularized. Nós também incluímos diferentes técnicas para determinar a proliferação celular e a viabilidade das células cultivadas no microcarriers. Além disso, demonstramos a funcionalidade das células após culturas de biorreator.
Abstract
Engenharia de tecidos é um campo promissor, focado no desenvolvimento de soluções para a crescente demanda em tecidos e órgãos em relação a fins de transplante. O processo para gerar tais tecidos é complexo e inclui uma combinação apropriada de tipos de células específicas, andaimes e estímulos físicos ou bioquímicos para orientar a diferenciação e crescimento celular. Microcarriers representam uma ferramenta atraente para expandir as células em um microambiente de tridimensional (3D), uma vez que fornecem maior superfície-para rácios de volume e imitar mais de perto a situação na vivo em comparação com métodos tradicionais bidimensionais. O sistema vascular, fornecendo oxigênio e nutrientes para as células e garantindo a remoção de lixo, constitui um importante bloco de construção quando gerando engenharia de tecidos. Na verdade, a maioria das construções falharem após ser implantado devido a falta de suporte vascular. Neste estudo, apresentamos um protocolo para a expansão de células endoteliais na recombinante microcarriers baseados em colágeno sob condições dinâmicas no balão do girador e biorreatores, e explicamos como determinar nesta viabilidade celular de configuração e funcionalidade. Além disso, propomos um método de entrega de celular para fins de vascularização sem etapas de desprendimento adicionais necessárias. Além disso, nós fornecemos uma estratégia para avaliar a vascularização celular potencial em um bioreator de perfusão em uma matriz biológica decellularized. Acreditamos que o uso dos métodos apresentados pode levar ao desenvolvimento de novas terapias baseadas em células para uma grande variedade de aplicações na prática clínica de engenharia de tecidos.
Introduction
Um problema geral em aplicações de engenharia de tecido é produzir uma massa de células alta com o fenótipo de diferenciação correta na localidade de necessidade. A aplicação de microcarriers para abordar esta questão começou em 1967 com o aumento da importância à data nos campos tais como a engenharia de tecidos ortopédicos para geração em grande escala de pele, ossos, cartilagens e tendões1. Eles permitem a manipulação de culturas aderentes em maneiras semelhante da suspensão de culturas2 expandindo células em substratos (3D) tridimensionais de microescala. Assim, as células experimentam um fornecimento de nutrientes homogêneo e interações célula-matriz, que levam a melhor manutenção na vivo3,4 diferenciação que muitas vezes é perdida ao longo do tempo em 2D se aproxima de5. Uma maior taxa de superfície e o volume – levando-o à célula maior rendimentos6,7, superior de gás e nutrientes taxas de câmbio, comparando a sistemas estáticos8, a possibilidade de regular e sujeita a cultura a física estímulos de9e o potencial para intensificação do processo de expansão7 são ainda mais vantagens. Vários recursos tais como o diâmetro, densidade, porosidade, carga de superfície e propriedades de adesão10,11 distinguem as diferentes disponíveis comercialmente micro e macro-operadoras. No entanto, dentre a principal vantagem é sua entrega potencial como microtissues com defeito de local ou demanda.
Para aplicações da tecnologia de microcarrier em engenharia de tecido ósseo, ilustramos em um anterior relatório12 a produção de um novo microcarrier tipo constituído de um colágeno recombinante peptídeo (RCP, comercialmente disponível como Cellnest). Esta nova microcarrier permite o GMP-compatível com a escala de produção de andaime e célula, conforme necessário para a entrega da célula em um cenário clínico. Neste contexto, ajuste de estabilidade do andaime, taxa de degradação e propriedades de superfície através da escolha adequada de uma estratégia adequada de reticulação permite adaptar a técnica para o aplicativo selecionado, tipo de interesse de célula ou tecido13-alvo. Em particular, o emprego potencial desta microcarrier como um sistema de entrega de celular injetável para aplicação terapêutica14 torna particularmente interessantes em um ambiente clínico.
Neste trabalho, ilustramos, por conseguinte, o processo de cultivo para o isolamento e a expansão de medula óssea-derivado mesenquimais estromais células humanas (hBMSCs) e dérmicas microvasculares endoteliais células humanas (HDMECs) na recombinação de colágeno-I-baseada microcarriers peptídeo-baseado e sua preparação para a entrega em um ambiente clínico. Além disso, descrevemos a protocolos adicionais úteis para a manutenção da viabilidade celular após a implantação.
Viabilidade celular após o implante na verdade é fortemente dependente da vascularização15,16,,17, que garante a troca de oxigênio e nutrientes e facilita a remoção do lixo. Biorreatores constituem uma abordagem para superar os desafios de vascularização em engenharia de tecidos e manter a viabilidade celular, através de perfusão de meio de cultura, fornecendo assim, oxigénio e nutrientes18. Aqui, podemos ilustrar um in vitro método para avaliar a capacidade de migração das células endoteliais microvasculares do microcarriers a RCP para um biomatriz e sua capacidade de contribuir para o novo de vascularização e angiogênese. Este biomatriz é um segmento decellularized de suínos jejuno denominado BioVaSc (andaime biológico vascularizado), rica em colágeno e elastina e com conservas de estruturas vasculares, que inclui uma artéria alimentação uma drenagem veia de19 que tem sido aplicado para questões de implantação20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um dos principal objetivos da microcarrier é a expansão das células, mantendo a sua diferenciação para entregar as células para o local de necessidade. O método representado introduzir RCP microcarriers onde as células foram capazes de anexar, proliferar e colonizar o microcarriers com densidade de pilha alta. Isto foi observado pelo live/dead coloração, em que mais de 90% de células viáveis foram detectados enquanto apenas poucas células mortas foram obtidas após 7 dias de culturas dinâmicas. Da mesma for…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa que conduz a estes resultados recebeu financiamento da União Europeia sétimo quadro programa FP7/2007-2013 sob contrato de concessão n ° 607051 (BIO-INSPIRE). Agradecemos Carolien van Spreuwel-Goossens da Fujifilm fabricação Europe B.V., a assistência técnica durante a fabricação de RCP e Werner Stracke do Instituto Fraunhofer para silicato pesquisa ISC, para obter assistência com a análise de SEM.
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
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