Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados
Summary
Este artículo describe la metodología detallada para preparar una matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulación de alto rendimiento de física y química señales mímico en vivo microambientes celulares y a identificar el entorno celular óptimo para las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) con perfiles de unicelulares.
Abstract
Microambientes celulares consisten en una variedad de señales, tales como factores de crecimiento, matrices extracelulares y las interacciones intercelulares. Estas señales están bien orquestados y son cruciales en la regulación de las funciones celulares en un sistema de vida. Aunque un número de investigadores ha intentado investigar la correlación entre factores ambientales y las funciones celulares deseadas, mucho sigue siendo desconocido. Esto es en gran parte debido a la falta de una metodología apropiada para imitar tales señales ambientales en vitroy probar simultáneamente señales ambientales diferentes en las células. Aquí, Divulgamos una plataforma integrada de canales de microfluidos y una variedad de nanofibras, seguida por análisis unicelular de alto contenido, para examinar células de fenotipos alterados por distintos factores ambientales. Para demostrar la aplicación de esta plataforma, este estudio se centra en los fenotipos de uno mismo-renovar las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs). Presentamos los procedimientos de preparación de una matriz de nanofibras y la estructura de microfluidos en la fabricación de una gama de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME). Por otra parte, se describen pasos generales de la célula solo perfiles, tinción con marcadores fluorescentes múltiples, múltiples imágenes de fluorescencia y análisis estadísticos, de la célula.
Introduction
Humanas pluripotentes células madre (hPSCs)1,2 uno mismo-renovar ilimitadamente y diferenciarse en varios linajes de tejido, que podrían revolucionar el desarrollo de fármacos, terapias basadas en células, ingeniería tisular y medicina regenerativa 3 , 4 , 5 , 6. platos de cultura general y las placas de microtitulación, sin embargo, no están diseñadas para permitir la manipulación precisa de la célula física y química a nivel celular con la gama de nano a micro-metros, que es un factor crítico para la extensión celular, auto renovación y diferenciación. Para solucionar este inconveniente, los estudios han investigado los roles de microambientes celulares en la regulación de las decisiones de destino celular y funciones de la célula4. En los últimos años, un creciente número de estudios se han realizado para reconstruir microambientes celulares in vitro7,8. Procesos de fabricación de nano y micro han establecido estos microambientes mediante la manipulación de productos químicos9,10,11,12,13, 14,15,16,17 y física18,19,20 señales ambientales. Hasta ahora no había informes de investigar sistemáticamente los mecanismos subyacentes de señales ambientales físicos y químicos en las decisiones de destino celular y funciones dentro de una única plataforma.
Aquí, presentamos una estrategia basada en los principios de diseño simple para establecer una plataforma de proyección sólida (figura 1). En primer lugar, describimos el procedimiento de desarrollo de una plataforma integrada para la creación de microambientes celulares versátiles, artificiales mediante una matriz de nanofibras y una estructura de microfluidos: matriz el multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) (Figura 1A y 2A). La matriz de nanofibras tiene 12 diferentes microambientes en diferentes combinaciones de materiales de nanofibras y densidades. Electrospinning fue utilizada para fabricar nanofibras. Los materiales de nanofibras, como poliestireno (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22y23de la gelatina (GT), fueron diseñados para poner a prueba sus propiedades químicas, que puedan afectar la adhesión celular y el mantenimiento de pluripotencia ( Figura 2B). Densidades de nanofibras fueron variadas por electrospinning tiempo cambiante y las nanofibras generadas fueron definidas según sus densidades (DNF, con D = XLow/Low/Mid/High). La estructura de microfluidos se compone de polidimetilsiloxano (PDMS) albergar 48 cámaras de cultivo celular, que pueden colocarse a lo largo de las dimensiones estándar de la microplaca de 96 pozos. PDMS es un polímero biocompatible y gas intercambiables que generalmente se utiliza para fabricar dispositivos de microfluidos24. Cada canal microfluídico fue diseñado para ser 700 μm ancho 8.4 mm de largo y tenía dos entradas en sus bordes (cuadro 1). Las cámaras tenían diferentes alturas (250, 500 y 1000 μm) para manipular las iniciales siembra celular densidades (0.3, 0.6 y 1.2 × 105 células/cm2), que pueden correlacionar con la supervivencia, proliferación y diferenciación de hPSCs25 (Figura 2C). El número de células sembradas en una cámara es proporcional a la densidad de la columna sobre el piso de la cámara, y así siembra la densidad de la célula inicial fue controlada introduciendo la misma suspensión de células en cámaras de cultivo con diferentes alturas. Todos los canales fueron diseñados para ser ≥ 250 μm de altura26 para minimizar los efectos de la tensión de oxígeno27 y tensión de esquileo28 en las células. Canal alturas de 250, 500 y 1000 μm son abreviados aquí como XCD con X = Low, Mid y High, respectivamente. Los ambientes con nanofibras distintas densidades y densidades de siembra de células iniciales fueron acortados como “Material_NF density_Cell densidad” (por ejemplo, GT_HighNF_HighCD: un entorno caracterizado por alta densidad GT nanofibras y alta inicial de la célula-siembra densidad).
Posteriormente, describimos cómo realizar el análisis unicelular para investigar sistemáticamente el comportamiento de la célula en respuesta a factores ambientales (figura 1B). Como una prueba de concepto, se identificaron el entorno celular óptimo para hPSC auto renovación, que es una función clave para hPSC mantenimiento (figura 1B)29. Citometría de imagen, seguida por análisis estadísticos, permite la interpretación cuantitativa de respuestas fenotípicas celulares individuales a entornos celulares. Entre una variedad de funciones celulares, este artículo proporciona un procedimiento detallado para identificar las condiciones óptimas para mantener hPSC auto renovación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo muestra el primer método de screening para establecer un sistema de cultivo sólido para el mantenimiento de hPSCs calificado. En primer lugar, hemos descrito cómo preparar una plataforma con diversas ECMs artificial y célula siembra densidades usando un dispositivo microfluídico integrado con una variedad de nanofibras, la matriz MACME. Phenotyping sola célula basada en imágenes en segundo lugar, cuantitativo fue realizado50 para evaluar los resultados celulares individuales …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Prof. N. Nakatsuji en iCeMS, Universidad de Kyoto, para proporcionar células madre embrionarias humanas. También agradecemos a Prof. A. Maruyama en Instituto de tecnología de Tokio por su apoyo en el uso del microscopio de fuerza atómica. Financiamiento fue proporcionado generosamente por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 y 24656502); la financiación también fue proporcionada por la nueva energía y organización de desarrollo de tecnologías industriales (NEDO) y la Fundación de Ciencias de la vida de Terumo. El WPI iCeMS es apoyado por el mundo Premier Internacional Investigación Centro iniciativa (IPM), el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (MEXT), Japón. Una parte de este trabajo fue apoyada por el centro de nanotecnología de Universidad de Kyoto y la planta de Nano-procesamiento de AIST en “Proyecto de plataforma de nanotecnología” patrocinado por MEXT, Japón.
Materials
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
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