Diese RNA Pulldown-Methode ermöglicht es, die RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA (LncRNA) zu identifizieren. Basierend auf der Hybridisierung von hausgemachten, gestaltete Gegenstrang DNA-Oligonukleotid Sonden spezifisch für diese LncRNA in einem entsprechend festen Gewebe oder Zell-Linie, ermöglicht es effizient die Erfassung aller RNA-Ziele von der LncRNA.
Lange nicht-kodierende RNA (LncRNA), die Sequenzen von mehr als 200 Nukleotiden ohne einen definierten Leseraster sind, gehören zu den regulatorischen nicht-kodierender RNA Familie. Obwohl ihre biologischen Funktionen weitgehend unbekannt bleiben, die Zahl dieser LncRNAs stetig gestiegen und es wird jetzt geschätzt, dass der Mensch mehr als 10.000 solcher Protokolle können. Einige davon sind bekanntermaßen wichtige regulatorische Signalwege der Genexpression beteiligt sein, die auf transkriptioneller Ebene, sondern auch auf verschiedenen Stufen der RNA co- und Posttranskriptionale Reifung stattfinden. In den letztgenannten Fällen haben RNAs, die durch das LncRNA ausgerichtet sind, identifiziert werden. Das ist der Grund, warum ist es sinnvoll, eine Methode, die es ermöglicht die Identifizierung der RNAs verbunden direkt oder indirekt mit einer LncRNA von Interesse zu entwickeln.
Dieses Protokoll, das von zuvor veröffentlichten Protokolle, so dass die Isolierung des LncRNA zusammen mit den zugehörigen Chromatin-Sequenzen inspiriert wurde, wurde angepasst um die Isolierung der zugehörigen RNAs zu ermöglichen. Wir festgestellt, dass zwei Schritte entscheidend für die Effizienz dieses Protokolls sind. Das erste ist das Design von spezifischen Anti-Sense DNA-Oligonukleotid Sonden zu hybridisieren, die LncRNA von Interesse. Zu diesem Zweck die LncRNA Sekundärstruktur wurde von Bioinformatik vorausgesagt und Gegenstrang Oligonukleotid Sonden wurden entwickelt, mit einer starken Affinität für Regionen, in denen eine geringe Wahrscheinlichkeit der internen Basenpaarung angezeigt. Der zweite entscheidende Schritt des Verfahrens stützt sich auf das Fixativ Bedingungen des Gewebes oder kultivierten Zellen, die das Netzwerk zwischen allen molekularen Partnern zu erhalten. Gepaart mit hohem Durchsatz RNA Sequenzierung, bieten diese RNA Pulldown-Protokoll der gesamten RNA Interaktom des LncRNA von Interesse.
Das übergeordnete Ziel des hier beschriebenen Verfahrens ist RNA Molekulare Partner eine lange nichtcodierender RNA (LncRNA) zu identifizieren. LncRNA Sequenzen von mehr als 200 Nukleotide ohne einen definierten Leseraster entsprechen. Einige von ihnen haben gezeigt, dass Ausdruck Genregulation, nicht nur auf transkriptioneller Ebene, sondern auch auf verschiedenen Stufen der RNA mit- und Posttranskriptionale Reifung beteiligt sein. In den letztgenannten Fällen sind Molekulare Partner von der LncRNA RNAs, die identifiziert werden. Entscheidend für die Entwicklung wäre eine Methode ermöglicht die Identifizierung der RNAs verbunden direkt oder indirekt mit einer LncRNA von Interesse.
Zuvor veröffentlichten Methoden, wie Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (ChIRP)1,2 und erfassen Hybridisierung Analyse der RNA Ziele (Diagramm)3,4, erlauben Hochdurchsatz-Entdeckung RNA-gebundene Proteine und genomische Bindungsstellen für einen bestimmten LncRNA. In diesen zwei Methoden, die LncRNA von Interesse war zuerst zu biotinylierte komplementären Oligonukleotiden hybridisiert, und die Anlage war dann isoliert mit Streptavidin-Perlen. Der Hauptunterschied zwischen diesen beiden Techniken bezieht sich auf das Design der Sonden, die auf LncRNAs. Zwitschern, die Strategie von RNA-Fisch, bestand aus einen Pool von kurzen komplementären DNA-Oligonukleotid Sonden decken die gesamte Länge der LncRNA Gestaltung inspiriert. Im Gegensatz dazu im Diagramm angepasst die Autoren einen RNase H Zuordnung Assay auf LncRNAs Websites zur Hybridisierung zu untersuchen.
Das Verfahren hier vorgeschlagene Design Gegenstrang DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden verwendet, die Bioinformatik Modellierung von LncRNA Sekundärstruktur5 markieren Sie mit einer starken Affinität für Regionen-Sonden, die eine geringe Wahrscheinlichkeit der internen anzeigen Base pairing. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass weniger teuer als solche auf Basis von Pools von Fliesen Oligonukleotid Sonden2 und weniger zeitaufwändig als solche auf Basis von RNAse-H Empfindlichkeit4.
Da gibt es eine wachsende Zahl von Beweisen für posttranskriptionelle Genregulation durch LncRNAs6, ist es sehr nützlich, um einen Ansatz ermöglicht die Erfassung von RNAs, die Ziele von einem LncRNA zu entwickeln. Darüber hinaus wurde der Ansatz für die meisten Anwendungen verwendbar, in kultivierten Zellen und Gewebe-Extrakte optimiert.
Lange Forensisches RNAs (LncRNAs) durch ihre Anzahl und Vielfalt ein großes Forschungsfeld dar, die meisten ihrer Rollen sind noch zu entdecken. Viele von diesen LncRNAs haben eine nukleare Lokalisierung und unter ihnen sind einige an rechtlichen Wege der Genexpression durch transkriptionelle oder posttranskritionelle Mechanismen beteiligt. Eines der aktuellen Herausforderungen in diesem Bereich ist die Relevanz dieser LncRNAs in Posttranskriptionale Verarbeitung von RNAs zu verstehen. Zu diesem Zweck müssen RNAs gezielt durch LncRNAs identifiziert werden. Inspiriert von früheren Studien konzentrierte sich auf die Vereinigung von LncRNAs mit Chromatin, entwickelten wir ein Verfahren, das von RNAs, die einem LncRNA zugeordnet werden können. Der Erfolg dieses Protokolls, namens RNA Pulldown-richtet sich vor allem auf zwei entscheidende Schritte, nämlich die Gestaltung der Gegenstrang DNA-Oligonukleotid Sonden, die speziell und ausschließlich mit der LncRNA von Interesse, und die Bedingungen des Gewebes zu hybridisieren oder Zelle-Fixierung, die die Integrität des Netzwerks zwischen allen molekularen Partnern zu erhalten.
Zuvor veröffentlichten Protokollen vorgesehenen Verfahren um eine LncRNA zusammen mit seinen zugehörigen Chromatin-Sequenzen (ChIRP1,2, Tabelle3,4) zu isolieren. In diesen Protokollen wurden verschiedene Strategien Design beschäftigt, die dem Gegenstrang DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden. In der ChIRP-Prozedur verwendet die Autoren einen Pool von DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden umfasst die gesamte Länge des LncRNA von Interesse nach Ausschluss aller überflüssig und nicht-spezifischen Sonden1,2. Protokoll der CHART die Autoren identifiziert die Bereiche der LncRNA, die zugänglicher für die Hybridisierung sind und Capture-Oligonukleotide, die auf diesen Gebieten entwickelt. Diese Regionen wurden aufgrund ihrer Empfindlichkeit RNase-H ausgewählt. In der Tat, mit der Eigenschaft der RNAse-H, hydrolyseneigung RNAs an Standorten der RNA-DNA-Bindung, der Oligonukleotide, die an zugänglichen Seiten in den LncRNA hybridisieren RNA-DNA-Hybriden zu produzieren und zu enzymatische Spaltung von der LncRNA führen. Die Autoren drei von diesen Kandidaten Erfassung Oligonukleotide ausgewählt und in ein cocktail3,4verwendet.
Das Verfahren zum Design der Gegenstrang DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden war nah an, die in das Diagramm-Protokoll verwendet, aber die Hybridisierung verfügbaren Regionen von der gewünschten LncRNA auf der Grundlage ihrer RNAse-H-Empfindlichkeit nicht ausgewählt wurden, sondern nach deren geringe Wahrscheinlichkeit der internen Basenpaarung wie von Bioinformatik Modellierung von LncRNA Sekundärstruktur bestimmt. Es muss festgestellt werden, dass verschiedene Sekundärstrukturen werden mit verschiedenen Algorithmen vorausgesagt werden, Sonden ausgewählt werden sollten diejenigen, die verfügbaren Sequenzen der LncRNA in der größten Zahl der Sekundärstrukturen vorhergesagt hybridisieren sein. Die gleichen Ergebnisse wurden erzielt mit entweder ein Cocktail aus drei entworfen, spezifische Sonden oder einer einzigen Sonde einzeln. Dies veranlasste die Verwendung von zwei separaten, spezifischen Sonden und die Berücksichtigung der positiven Ergebnisse als jene, die für diese zwei Sonden sind. Endlich, es wird daher empfohlen, am Anfang der Entwicklung der Methode, für ein optimales Ergebnis und Sonden, die Spezifität der Ergebnisse das Pulldown-Menü, 3 verschiedene Anti-Sense-Oligonukleotid entwerfen bewerten zu können und dann zu vergleichen experimentell ihre Effizienz, zumal Sonde Effizienz durch Zelle lysate Vorbereitung verändert werden kann. Dennoch, das Verfahren der Sonde Design basierend auf Bioinformatik Modellierung von LncRNA sekundäre Struktur verwendeten wir preiswerter als die basierend auf Pools von Fliesen Oligonukleotid Sonden2blieb, und das war weniger zeitaufwändig als die Methode basiert RNAse-H Empfindlichkeit4.
Eine negative Kontrolle sollte auch mit negativen erfassen Oligonukleotid entweder die Sinne DNA biotinylierte Oligonukleotid Sonden durchgeführt werden oder Rührei Oligonukleotid Sonden oder gegen eine unabhängige RNA-Oligonukleotide. Wegen der Existenz der natürlichen antisense Transkripte LncRNAs möglicherweise Verwendung von Sinn Oligonukleotid Sonden manchmal unzureichend. Unabhängig von der Oligonukleotid-Sonde für die negativ-Kontrolle ausgewählt ist es notwendig, durch Explosion zu überprüfen, die es nicht mit einem bekannten RNA hybridisieren und im Auge zu behalten, die diese Oligonukleotid, noch un-kommentierte LncRNA hybridisieren kann.
Die Zelle Lysates verwendet diese RNA Pulldown-Experimente stammen aus 106 bis 107 Zellen bei der Arbeit mit kultivierten Zellen und von 1 bis 10 mg, bei der Arbeit mit Gewebe. Die Vorbereitung der Zelle Lysates muss angepasst werden, je nach Gewebe oder Zellen verwendet mit zwei Hauptschritte, die optimiert werden müssen: nämlich die Vernetzung Schritt, die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den LncRNA und ihren molekularen Partnern ermöglicht und die Beschallung-Schritt, der die Viskosität verringert durch Schreddern Chromatin.
Das Ziel der Vernetzung Schritt soll sicherstellen, dass alle RNA-Ziele für den LncRNA geschlossen bleiben, durch Induktion der Bildung eines Netzwerkes zwischen allen Partnern der molekularen. Ein Paraformaldehyd Behandlungsschritt, die bilden kovalente Bindungen zwischen den LncRNA und ihren Partnern kann das Netzwerk sein netzartige. Im Diagramm Protokoll, es wurde vorgeschlagen, wenn arbeiten mit nuklearen LncRNA, um eine erste Behandlung mit Paraformaldehyd durchzuführen, im großen und ganzen lysate Zelle und eine zweite Behandlung am isoliert Nukleinsäuren Bruchteil3,4. Wir beobachteten, dass dieser zusätzliche Schritt die Effizienz der Sonden, wahrscheinlich verringert durch die Reduzierung der LncRNA Zugänglichkeit in den Zellen. Daher der Grad der Vernetzung von Paraformaldehyd muss unter Berücksichtigung der Zelle angepasst oder Gewebetyp verwendet, die Lokalisierung von LncRNA von Interesse, und die Effizienz der entworfenen Sonden.
Während der Lyse der Zellen, das Chromatin ist in der lysate freigegeben und erhöht seine Viskosität; Es ist dann notwendig, um das Chromatin durch Ultraschallbehandlung zu erhöhen die Fließfähigkeit der Proben und erleichtern damit die Zugänglichkeit des Oligonukleotids Zerkleinern, die LncRNA von Interesse-Sonden. Jedoch wird Beschallung auch Schreddern der RNAs extrahiert mit der LncRNA von Interesse. Es ist dann wichtig, die beschallungsdauer so minimieren, dass es effizient reduziert die Viskosität von der lysate, erlaubt es auch, dass die Einholung der RNA Fragmente mit einer Länge zwischen 200-800 BP. Hinweis enthalten, die die beschallungsdauer hoch werden abhängig von der Menge und der Art des Gewebes oder kultivierten Zellen verwendet.
Abschließend ermöglicht die hier beschriebene Vorgehensweise in 2-3 Tagen die Erfassung der RNA Ziele der gewünschten LncRNA. Gepaart mit RT-qPCR, werden diese Methoden ermöglichen eine Verordnung für eine mRNA und bestimmte Zuordnung durch die gewünschte LncRNA als Kandidat Ansatz suchen. Für eine genomweite Ansatz können RNA Pulldown-Experimente von Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung ermöglicht den Abruf von allen RNAs, verbunden mit der gewünschten LncRNA analysiert werden. Was die analytische Strategie gewählt, sollte das RNA-Pulldown-Verfahren neuen wichtigen Erkenntnisse über RNA-Verordnung von LncRNAs vermitteln.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Universität Aix-Marseille und CNRS und finanziert durch einen Zuschuss von Pfizer Laboratorien.
Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetic streptavidin beads |
Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | |
Gel electrophoresis apparatus | Advance | Mupid-One | Gel electrophoresis apparatus |
Proteinase K | Sigma | P2308 | |
RNA XS purification kit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA purificationkit |
RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596018 | RNA purification |
Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcription kit |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
Applied 7500 Fast | Thermo-Fisher | 4351107 | qPCR apparatus |
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit | Illumina | 20020594 | DNA library construction kit |
Illumina NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | NGS system |