Multicopy plazmid rolü antibiyotik direnci gelişimi test
Summary
Burada multicopy plazmid rolü antibiyotik direncinin evrime sınamak için deneysel bir yöntem mevcut.
Abstract
Multicopy plazmid Prokaryotlarda son derece bol miktarda bulunmaktadır ancak bakteri evriminin içindeki rollerine kötü anlaşılır kalır. Biz son zamanlarda Gen kopya numarası multicopy plazmid tarafından sağlanan hücre başına artış plazmid kodlanmış genler evrimi hızlandırmak gösterdi. Bu çalışmada, biz multicopy plazmid gen evrim teşvik yeteneğini test etmek için deneysel bir sistem mevcut. Basit moleküler biyoloji yöntemleri kullanarak, nerede bir antibiyotik direnci gen Escherichia coli MG1655, kromozom veya multicopy bir plazmid üzerinde içine yerleştirilebilecek bir modeli sistemi inşa edilmiştir. Antibiyotiklerin konsantrasyonları artan altında farklı suşları yaymak için bir deneysel evrim yaklaşım kullanmak ve bakteriyel nüfus yaşama zamanla ölçüyoruz. Böylece gen sadece direnç mutasyonları edinimi ile görüşmek antibiyotik molekül ve direnç gen seçimdir. Bu “evrimsel kurtarma” yaklaşım antibiyotik direnci edinimi tanıtmak için multicopy plazmid potansiyelini test etmek için basit bir yöntem sağlar. Deneysel sistem sonraki adımda antibiyotik direnci moleküler üsleri karakterizedir. Mutasyonlar tanımlamak için antibiyotik direnci edinimi için sorumlu tüm nüfus ve klonlar elde örnekleri derin DNA sıralama kullanın. Son olarak, altında eğitim gen mutasyonların rolü onaylamak için biz onları ebeveyn arka planda yeniden ve direnç fenotip elde edilen suşların sınayın.
Introduction
Bakterilerde antibiyotik direnci önemli bir sağlık sorunu1‘ dir. Temel düzeyde, antibiyotik direnci patojen bakteri yayılmasını evrimin doğal seleksiyon2,3tarafından basit bir örnektir. Basitçe söylemek gerekirse, kullanma-in antibiyotik dirençli suşların için seçim oluşturur. Bir anahtar Evrimsel Biyoloji, bu nedenle, antibiyotik direnç gelişmeye bakteriyel nüfus yeteneğini etkileyen faktörleri anlamak için sorundur. Seçim deneyler bakterilerin Evrimsel Biyoloji araştırmak için çok güçlü bir araç olarak ortaya çıktı ve bu alanda inanılmaz geniş bir evrimsel sorunları4,5,6anlayışlar üretti. Deneysel evrim, bakteriyel nüfus tek bir ebeveyn yük başlatılan seri olarak tanımlanmış ve sıkı şekilde denetlenen koşullar altında pasajlı. Bazı bu kültürler büyüme sırasında meydana gelen mutasyonlar bakteriyel fitness artırmak ve bunlar kültürler seçim doğal tarafından yayıldı. Deneme sırasında nüfus örnekleri belirli aralıklarla cryogenically donmuş fosil kaydı olmayan gelişen oluşturmak için korunur. Yaklaşımlar geniş bir dizi bakteriyel nüfus gelişen karakterize etmek için kullanılabilir, ama onların uzak ataları ve olan tüm genom sıralamanın karşı gelişti bakteri rekabet yeteneğini ölçen fitness deneyleri iki en yaygın yöntem vardır Bu sürücü adaptasyon genetik değişiklikleri tanımlamak için kullanılır. Richard Lenski ve meslektaşları7,8öncü çalışmaları deneysel evrim standart yaklaşımda Çoğalt nüfusun nispeten az sayıda meydan olmuştur (genellikle < 10) yeni bir uyum ile Yeni karbon kaynakları, sıcaklık veya yırtıcı fajının gibi çevresel meydan okuma.
Direnç antibiyotik konsantrasyonları hasta dokularda ölümcül seviyelere artırmak mümkün değildir yüksek olduğunda antibiyotik dirençli bakterilerin neden olduğu enfeksiyonların büyük bir sorun haline. Klinisyenler ne bu eşik antibiyotik konsantrasyonu, klinik kesme noktası yüksek dozda antibiyotik direnç gelişmeye bakteri sağlar bu nedenle ilgilendi. Bu deneysel çalışmaya nasıl? Bakteriyel nüfus az sayıda yüksek dozda antibiyotik ile meydan, Lenski stilin olduğu gibi deneme, daha sonra büyük olasılıkla sonucu tek antibiyotik tüm nüfus için extinction götürmek olacaktır. Kullanılan antibiyotik doz düşük minimum inhibitör konsantrasyonu ebeveyn gerginliği, (MIC) ise aynı zamanda, o zaman bu özellikle eğer bakteriyel nüfus direnç, klinik düzeyde gelişecek düşüktür direnç büyük maliyeti taşır. Bu iki senaryoyu arasında bir uzlaşma “evrimsel kurtarma” deney9,10,11kullanmaktır. Bu yaklaşımda, kültürler, çok sayıda (genellikle > 40) ile zaman içinde genellikle antibiyotik konsantrasyon ikiye katlayarak her gün12artış antibiyotik doz meydan. Bu deney damgasını artan direnç gelişmeye değil herhangi bir popülasyon için extinction tahrik olduğunu. Bu şekilde meydan çoğu nüfus soyu tükenmiş tahrik, ama küçük bir azınlık direnci yüksek düzeyde gelişen tarafından devam edecek. Bu yazıda, bu deneysel tasarım evrim multicopy plazmid katkısını direnç araştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Bakteri iki asıl yol, kromozomal mutasyonlar ve mobil genetik elemanları, çoğunlukla plazmid13edinimi antibiyotik direnç kazanır. Çünkü onlar arasında konjugasyon14,15bakterilerin direnç genleri aktarmak mümkün plazmid antibiyotik direnci gelişiminde önemli rol oynar. Plazmid boyutu ve Biyoloji göre iki gruba ayrılabilir: “küçük”, bakteri hücre ve “büyük” başına yüksek kopya numarası ile düşük ile kopyalayın sayı16,17. Direnci ve çoklu direnç bakteri15arasında yayılması anahtar sürücüleri vardır Konjügatif plazmid içerdiğinden evrim antibiyotik direnci ve büyük plazmid rolü kapsamlı bir şekilde belgelenmiş oldu. Küçük multicopy plazmid da bakteri17,18içinde son derece yaygındır ve genellikle antibiyotik direnç genleri19için kod. Ancak, küçük multicopy plazmid antibiyotik direnci gelişiminde rolü daha az bir ölçüde inceledi.
Bir son çalışmada, multicopy plazmid gen mutasyon oranları daha yüksek Gen kopya numarası cep12başına nedeniyle artırarak taşıdıkları genler evrimi hızlandırmak önerdi. Bir deneme modeli kullanarak e.coli suşu MG1655 ve β-lactamase gen blaTEM-1 bu multicopy plazmid görünüm üçüncü nesil direnci veriyor TEM-1 mutasyonların oranı hızlandırılmış gösterildi sefalosporin ceftazidime. Bu sonuçlar multicopy plazmid antibiyotik direnci gelişiminde önemli bir rol oynayabileceği belirtti.
Burada, biz geliştirdik yöntemi ayrıntılı bir açıklama mevcut antibiyotik direnci plazmid aracılıklı multicopy evrimi araştırmak için. Bu yöntem üç farklı adımlar vardır: gen altında eğitim multicopy bir plazmid veya ana bilgisayar bakteri kromozom ilk, ekleme. İkinci olarak, deneysel evrim (evrimsel kurtarma) seçici basınç adapte farklı suşları potansiyelini değerlendirmek için kullanın. Ve üçüncü, plazmid aracılıklı evrim sıralama ve ebeveyn genotip şüpheli mutasyonların tek tek yeniden yapılandırma DNA’yı kullanarak temel moleküler olarak belirlenmesi.
Burada açıklanan protokol antibiyotik direnci evrimi araştırmak için tasarlanmış olsa da, son olarak, bir bu yöntem genellikle mutasyonlar tarafından herhangi bir multicopy elde yenilikler evrimi analiz etmek yararlı olabilir iddia edebilirsiniz Plazmid kodlanmış gene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz moleküler biyoloji, deneysel evrim ve evrim bakterilerde antibiyotik direnci ve multicopy plazmid rolünü araştırmak için tasarlanmış derin DNA sıralama birleştiren yeni bir iletişim kuralı mevcut. Her ne kadar bu iletişim kuralı teknikleri farklı alanlardan birleştiren, onu geliştirmek için gereken tüm yöntemleri basit ve düzenli Mikrobiyoloji laboratuvar olarak gerçekleştirilebilir. Protokol en kritik adımlarda muhtemelen modeli sistem suşları inşası ve yeniden yapılanma (ki tam olarak a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Instituto de tarafından desteklenen Salud Carlos III (Plan Estatal de ben + D + ben 2013-2016): CP15-00012, PI16-00860 ve CIBER (CB06/02/0053), ortak ” Europe ulaşmanın bir yolu ” Avrupa Kalkınma bölgesel Fonu tarafından finanse hibe (ERDF). JAE Madrid (2016-T1/biyo-1105) ve ben hükümet Atracción de talento program tarafından desteklenmektedir + D Excelencia, İspanyol “gayri resmi” de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM: Instituto de Miguel Servet bursu tarafından desteklenmektedir Salud Carlos III (MS15/00012) ortak Avrupa Sosyal Fonu tarafından finanse edilen “senin geleceğine yatırım” (ESF) ve ERDF.
Materials
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
References
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
- Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
- Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
- Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
- Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
- Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
- San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
- Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
- Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
- Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
- San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
- Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d’Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
- Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
- . . Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , (2009).
- Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
- Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
- Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
- Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).
