Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen
Summary
Hier präsentieren wir eine experimentelle Methode, um die Rolle des multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen zu testen.
Abstract
Multicopy Plasmide sind sehr reichlich in Prokaryoten, aber ihre Rolle in der bakteriellen Evolution bleibt schlecht verstanden. Vor kurzem zeigten wir, dass der Anstieg gen Kopienzahl pro Zelle von multicopy Plasmide zur Verfügung gestellt die Entwicklung der Plasmid-kodierte Gene beschleunigen könnte. In dieser Arbeit präsentieren wir ein experimentelles System um zu testen, die Fähigkeit des multicopy Plasmide gen Entwicklung zu fördern. Mit einfachen molekularbiologische Methoden, errichteten wir ein Modellsystem, wo eine Antibiotika-Resistenz-Gen in Escherichia coli MG1655, in das Chromosom oder auf ein multicopy Plasmid eingefügt werden können. Wir verwenden einen experimentelle Evolution Ansatz, um die verschiedenen Stämme unter steigenden Konzentrationen von Antibiotika zu propagieren und Überleben der Bakterienpopulationen im Laufe der Zeit messen. Die Wahl der Antibiotika Molekül und die Resistenz-Gen ist, dass das Gen nur Widerstand durch den Erwerb von Mutationen verleihen kann. Dieser “evolutionären Rettung” Ansatz bietet eine einfache Methode um zu testen, das Potenzial des multicopy Plasmide, die Übernahme von Antibiotika-Resistenzen zu fördern. Im nächsten Schritt des experimentellen Systems zeichnen sich die molekularen Grundlagen der Antibiotika-Resistenz. Um Mutationen zu identifizieren verantwortlich für den Erwerb von Antibiotika-Resistenzen verwenden wir Tiefe DNA-Sequenzierung von Proben aus ganzer Bevölkerungen und Klone. Schließlich, um die Rolle der Mutationen im Gen unter Studie zu bestätigen, wir im elterlichen Hintergrund zu rekonstruieren und Widerstand Phänotyp der daraus resultierenden Belastungen zu testen.
Introduction
Antibiotika-Resistenz bei Bakterien ist ein großes gesundheitliches Problem1. Auf einer grundlegenden Ebene ist die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen bei pathogenen Bakterien ein einfaches Beispiel der Evolution durch natürliche Selektion2,3. Einfach ausgedrückt, generiert die Anwendung von Antibiotika Auswahl für resistente Stämme. Ein zentrales Problem in der Evolutionsbiologie, deshalb, um die Faktoren zu verstehen, die Einfluss auf die Fähigkeit der Bakterienpopulationen zu Resistenzen gegen Antibiotika entwickeln. Auswahl Experimente entstanden als ein sehr mächtiges Werkzeug um die Evolutionsbiologie von Bakterien zu untersuchen hat, und dieses Feld unglaubliche Einblicke in eine Vielzahl von evolutionären Probleme4,5,6. In experimentelle Evolution sind seriell Bakterienpopulationen initiiert von einem einzigen elterlichen Belastung unter definierten und streng kontrollierten Bedingungen passagiert. Einige Mutationen, die während des Wachstums dieser Kulturen auftreten bakterieller Fitness steigern und diese zu verbreiten durch die Kulturen durch natürliche Selektion. Während des Experiments sind Proben der Bevölkerungen in regelmäßigen Abständen tiefkalt beibehalten, um nicht weiterentwickelnden gefrorenen fossilen aufzuzeichnen. Eine Vielzahl von Ansätzen lässt sich entwickelnden Bakterienpopulationen zu charakterisieren, aber die zwei am häufigsten verwendeten Methoden sind Fitness-Assays, die messen die Fähigkeit der weiterentwickelten Bakterien konkurrieren gegen ihre Vorfahren und kompletten Genoms, das ist verwendet, um den genetischen Veränderungen, dass Laufwerk Anpassung identifizieren. Nach Pionierarbeit von Richard Lenski und Kollegen7,8, der Standardansatz in experimentelle Evolution wurde gegen eine relativ kleine Anzahl von replizieren Bevölkerungen (in der Regel < 10) mit der Anpassung an eine neue umweltpolitische Herausforderung, wie neue Kohlenstoffquellen, Temperatur oder eine räuberische Phagen.
Infektionen durch Antibiotika-resistente Bakterien werden ein großes Problem, wenn Widerstand hoch genug ist, dass es nicht möglich, Antibiotika-Konzentrationen zu tödlichen Niveaus in Patienten Gewebe zu erhöhen. Ärzte sind daher interessiert was ermöglicht Bakterien Resistenz gegen hohe Dosen von Antibiotika zu entwickeln, die über diese Antibiotika Grenzkonzentration, der klinischen Haltepunkt liegen. Wie um dies experimentell zu studieren? Wenn eine kleine Anzahl von Bakterienpopulationen mit einer hohen Dosis des Antibiotikums herausgefordert werden, wie in einem Lenski-Stil Experiment, dann das wahrscheinlichste Ergebnis ist, dass das Antibiotikum alle Bevölkerungen zum Aussterben führen wird. Zur gleichen Zeit wenn die Dosis des Antibiotikums, die verwendet wird niedrig, unterhalb der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) des elterlichen Stammes ist ist dann es unwahrscheinlich, dass sich die Bakterienpopulationen klinisch relevante Ebenen des Widerstandes, vor allem, wenn Widerstand trägt eine große Kosten. Ein Kompromiss zwischen diesen beiden Szenarien ist eine “evolutionäre Rettung” Experiment9,10,11zu verwenden. Dieser Ansatz bietet eine sehr große Anzahl von Kulturen (in der Regel > 40) ist mit Dosen von Antibiotika, die im Laufe der Zeit in der Regel erhöhen durch eine Verdoppelung der Antibiotika Konzentration jeden Tag12gefordert. Das Markenzeichen dieses Experiments ist, dass eine Bevölkerung, die nicht erhöhten Resistenz entwickelt zum Aussterben getrieben wird. Die meisten Populationen, die auf diese Weise in Frage gestellt werden werden ausgestorben getrieben, aber eine kleine Minderheit bleibt bestehen, durch die sich verändernden hohes Maß an Widerstand. In diesem Beitrag zeigen wir Verwendung von dieser Versuchsanordnung multicopy Plasmid Beitrag zur Evolution des Widerstands zu untersuchen.
Bakterien resistent gegen Antibiotika durch zwei Hauptrouten, chromosomalen Mutationen und Akquisition von mobile genetische Elemente, vor allem Plasmide13. Plasmide spielen eine Schlüsselrolle in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen, weil sie sich Resistenzgene zwischen Bakterien durch Konjugation14,15übertragen können. Plasmide können in zwei Gruppen entsprechend ihrer Größe und Biologie unterteilt werden: “klein”, mit hohen Kopienzahl pro Bakterienzelle und “large”, mit niedrigen kopieren Nummer16,17. Die Rolle der großen Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen ist ausführlich dokumentiert worden, weil sie konjugative Plasmide enthalten die wichtigsten Triebkräfte für die Verbreitung der Resistenz und Multi-Resistenz Bakterien15sind. Kleinen multicopy Plasmide sind ebenfalls sehr häufig in Bakterien17,18, und sie oft code für Antibiotika-Resistenz-Gene-19. Allerdings ist die Rolle des kleinen multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen in geringerem Umfang untersucht worden.
In einer neueren Arbeit haben wir vorgeschlagen, multicopy Plasmide die Entwicklung der Gene tragen sie durch die Erhöhung gen Mutationsraten aufgrund der höheren gen Kopienzahl pro Zelle12beschleunigen könnte. Mit einem experimentellen Modell mit E. Coli -Stamm MG1655 und β-Lactamase-gen BlaTEM-1 zeigte sich, dass multicopy Plasmide beschleunigt die Rate des Auftretens von TEM-1 Mutationen verleihen Resistenz gegen die dritte generation Cephalosporin Ceftazidim. Diese Ergebnisse zeigten, dass multicopy Plasmide eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen spielen könnte.
Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung der Methode wir entwickelt haben, um die multicopy Plasmid-vermittelten Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen zu untersuchen. Diese Methode hat drei Stufen: Erstens Einfügen des Gens untersuchten in einem multicopy Plasmid oder das Chromosom des Bakteriums Host. Zweitens der experimentelle Evolution (evolutionäre Rettung) verwenden Sie, um das Potenzial der verschiedenen Stämme zur Anpassung an den Selektionsdruck zu beurteilen. Und drittens, Bestimmung der molekularen Grundlagen Plasmid-vermittelten Evolution mit der DNA Sequenzierung und die Rekonstruktion der vermuteten Mutationen einzeln in das elterliche Erbgut zugrunde.
Schließlich, obwohl das hier beschriebene Protokoll entwickelt wurde, um die Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen zu untersuchen, kann man argumentieren, dass diese Methode in der Regel sinnvoll, die Entwicklung von Innovationen, die durch Mutationen in jedem Multicopy erworben zu analysieren sein könnte Plasmid-kodierte gen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir präsentieren ein neues Protokoll, die Kombination von Molekulare Biologie, experimentelle Evolution und tiefen DNA-Sequenzierung, die entworfen, um die Rolle des multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen bei Bakterien zu untersuchen. Obwohl dieses Protokoll Techniken aus verschiedenen Bereichen verbindet, alle Methoden zu entwickeln sind einfach und in einem regelmäßigen Mikrobiologie-Labor durchgeführt werden können. Die wichtigsten Schritte im Protokoll sind wahrscheinlich den Bau von M…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Instituto de Salud Carlos III (Plan Estatal de ich + D + ich 2013-2016): gewährt CP15-00012, PI16-00860 und CIBER (CB06/02/0053), kofinanziert durch den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung ” einen Weg, um Europa zu erreichen”(EFRE). JAE wird unterstützt durch das Atracción de Talento -Programm der Regierung der Region Madrid (2016-T1/BIO-1105) und die I + D Shmeissani von das spanische Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM wird unterstützt durch ein Miguel Servet Stipendium vom Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) kofinanziert durch den Europäischen Sozialfonds “Investition in Ihre Zukunft” (ESF) und EFRE.
Materials
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
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