एंटीबायोटिक प्रतिरोध के विकास में Multicopy Plasmids की भूमिका का परीक्षण
Summary
यहाँ हम एंटीबायोटिक प्रतिरोध के विकास में multicopy plasmids की भूमिका का परीक्षण करने के लिए एक प्रयोगात्मक विधि पेश करते हैं ।
Abstract
Multicopy plasmids prokaryotes में बेहद प्रचुर मात्रा में हैं लेकिन जीवाणु विकास में उनकी भूमिका खराब समझी जाती है. हम हाल ही में पता चला कि multicopy plasmids द्वारा प्रदान की सेल प्रति जीन प्रति संख्या में वृद्धि प्लाज्मिड के विकास में तेजी लाने के जीन इनकोडिंग सकता है । इस काम में, हम एक प्रयोगात्मक प्रणाली वर्तमान multicopy plasmids की क्षमता का परीक्षण करने के लिए जीन विकास को बढ़ावा देने के । सरल आणविक जीवविज्ञान विधियों का प्रयोग, हम एक मॉडल प्रणाली का निर्माण किया, जहां एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन ई कोलाई MG1655 में डाला जा सकता है, या तो गुणसूत्र में या एक multicopy प्लाज्मिड पर. हम एक प्रयोगात्मक विकास दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की बढ़ती सांद्रता के तहत अलग उपभेदों प्रचार और हम समय के साथ बैक्टीरियल आबादी का अस्तित्व उपाय । एंटीबायोटिक अणु और प्रतिरोध जीन का चुनाव इतना है कि जीन केवल उत्परिवर्तनों के अधिग्रहण के माध्यम से प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं । यह “विकासवादी बचाव” दृष्टिकोण एंटीबायोटिक प्रतिरोध के अधिग्रहण को बढ़ावा देने के लिए multicopy plasmids की क्षमता का परीक्षण करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है । प्रायोगिक प्रणाली के अगले कदम में, एंटीबायोटिक प्रतिरोध के आणविक ठिकानों की विशेषता है । एंटीबायोटिक प्रतिरोध के अधिग्रहण के लिए जिंमेदार उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए हम पूरी आबादी और क्लोन से प्राप्त नमूनों की गहरी डीएनए अनुक्रमण का उपयोग करें । अंत में, अध्ययन के तहत जीन में उत्परिवर्तनों की भूमिका की पुष्टि करने के लिए, हम उंहें पैतृक पृष्ठभूमि में पुनर्निर्माण और परिणामस्वरूप उपभेदों के प्रतिरोध phenotype परीक्षण ।
Introduction
बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध एक प्रमुख स्वास्थ्य समस्या है1। एक बुनियादी स्तर पर, रोगजनक बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध के प्रसार प्राकृतिक चयन2,3द्वारा विकास का एक सरल उदाहरण है । रखो बस, एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग प्रतिरोधी उपभेदों के लिए चयन उत्पंन करता है । विकासवादी जीवविज्ञान में एक महत्वपूर्ण समस्या है, इसलिए, कारकों है कि जीवाणु आबादी की क्षमता को प्रभावित करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोध विकसित समझ है । चयन प्रयोगों बैक्टीरिया की विकासवादी जीवविज्ञान की जांच करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है, और इस क्षेत्र विकासवादी समस्याओं की एक विस्तृत श्रृंखला में अविश्वसनीय अंतर्दृष्टि का उत्पादन किया गया है4,5,6। प्रयोगात्मक विकास में, एक एकल पैतृक तनाव से शुरू बैक्टीरियल आबादी प्रश्नपत्र परिभाषित और कसकर नियंत्रित शर्तों के तहत पारित कर रहे हैं । उत्परिवर्तनों के कुछ है कि इन संस्कृतियों के विकास के दौरान हो बैक्टीरियल स्वास्थ्य में वृद्धि, और इन संस्कृतियों के माध्यम से प्राकृतिक चयन द्वारा फैल गया । प्रयोग के दौरान, आबादियों के नमूनों को आवधिक रूप से एक गैर-जमे हुए जीवाश्म रिकॉर्ड तैयार करने के लिए रखा जाता है । दृष्टिकोण की एक विस्तृत संख्या के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बैक्टीरियल आबादी विकसित विशेषताएं, लेकिन दो सबसे आम तरीकों फिटनेस परख रहे हैं, कि विकसित बैक्टीरिया की क्षमता को मापने के लिए उनके दूर पूर्वजों के खिलाफ प्रतिस्पर्धा, और पूरे जीनोम अनुक्रमण, कि है आनुवंशिक परिवर्तन है कि ड्राइव अनुकूलन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया । रिचर्ड Lenski और सहयोगियों7,8द्वारा अग्रणी काम के बाद, प्रयोगात्मक विकास में मानक दृष्टिकोण को दोहराने की आबादी की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या को चुनौती दी गई है (आमतौर पर < 10) एक नया करने के लिए अनुकूल के साथ इस तरह के नए कार्बन स्रोतों, तापमान, या एक शिकारी फेज के रूप में पर्यावरण चैलेंज, ।
एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया की वजह से संक्रमण एक बड़ी समस्या बन जाता है जब प्रतिरोध पर्याप्त उच्च है कि रोगी के ऊतकों में घातक स्तर के लिए एंटीबायोटिक सांद्रता को बढ़ाने के लिए संभव नहीं है । चिकित्सकों इसलिए क्या बैक्टीरिया एंटीबायोटिक की उच्च खुराक है कि इस सीमा एंटीबायोटिक एकाग्रता, नैदानिक विराम बिंदु से ऊपर है के लिए प्रतिरोध विकसित करने की अनुमति देता में रुचि रखते हैं । इस प्रयोग का अध्ययन कैसे करें? अगर बैक्टीरियल आबादी की एक छोटी संख्या एंटीबायोटिक की एक उच्च खुराक के साथ चुनौती दी है, के रूप में एक Lenski शैली प्रयोग में है, तो सबसे अधिक संभावना परिणाम यह है कि एंटीबायोटिक लुप्त होने के लिए आबादी के सभी ड्राइव करेंगे । एक ही समय में, अगर एंटीबायोटिक की खुराक है कि प्रयोग किया जाता है कम है, माता पिता के तनाव के ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) नीचे, तो यह संभावना नहीं है कि जीवाणु आबादी प्रतिरोध के नैदानिक प्रासंगिक स्तर विकसित होगा, खासकर अगर प्रतिरोध एक बड़ी लागत वहन करती है । इन दो परिदृश्यों के बीच एक समझौता एक “विकासवादी बचाव” प्रयोग9,10,11का उपयोग करने के लिए है । इस दृष्टिकोण में, संस्कृतियों की एक बहुत बड़ी संख्या (आमतौर पर > 40) एंटीबायोटिक दवाओं की खुराक के साथ चुनौती दी है कि समय के साथ वृद्धि, आमतौर पर एंटीबायोटिक एकाग्रता दोहरीकरण द्वारा हर दिन12. इस प्रयोग की बानगी यह है कि किसी भी आबादी है कि वृद्धि प्रतिरोध विकसित नहीं विलुप्त होने के लिए प्रेरित किया जाएगा । ज्यादातर आबादी है कि इस रास्ते में चुनौती दी है विलुप्त होती संचालित किया जाएगा, लेकिन एक छोटे से अल्पसंख्यक प्रतिरोध के उच्च स्तर पर विकसित होने से बनी रहेगी । इस पत्र में, हम बताते है कि कैसे इस प्रयोगात्मक डिजाइन प्रतिरोध के विकास के लिए multicopy प्लाज्मिड योगदान की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
बैक्टीरिया दो प्रमुख मार्गों के माध्यम से एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोध प्राप्त, गुणसूत्र उत्परिवर्तनों, और मोबाइल आनुवंशिक तत्वों के अधिग्रहण, ज्यादातर plasmids13। Plasmids एंटीबायोटिक प्रतिरोध के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, क्योंकि वे विकार14,15द्वारा बैक्टीरिया के बीच प्रतिरोध जीन हस्तांतरण करने में सक्षम हैं । Plasmids अपने आकार और जीव विज्ञान के अनुसार दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है: “छोटे”, जीवाणु कोशिका और “बड़े” प्रति उच्च प्रति संख्या के साथ, कम कॉपी संख्या16,17के साथ. एंटीबायोटिक प्रतिरोध के विकास में बड़े plasmids की भूमिका बड़े पैमाने पर प्रलेखित किया गया है क्योंकि वे conjugative plasmids, जो प्रतिरोध और बैक्टीरिया के बीच बहु प्रतिरोध के प्रसार के प्रमुख ड्राइवरों15शामिल हैं । छोटे multicopy plasmids भी बहुत बैक्टीरिया17,18में आम हैं, और वे अक्सर एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन19के लिए कोड । हालांकि, एंटीबायोटिक प्रतिरोध के विकास में छोटे multicopy plasmids की भूमिका एक हद तक कम करने के लिए अध्ययन किया गया है ।
हाल के एक काम में, हम प्रस्ताव किया है कि multicopy plasmids जीन के विकास में तेजी लाने के लिए वे जीन उत्परिवर्तन उच्च सेल के प्रति अधिक जीन प्रति संख्या के कारण दरों में वृद्धि से ले सकता है12। ई. कोलाई तनाव MG1655 और β-lactamase जीन ब्लॅकउनि-1 के साथ एक प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग कर यह दिखाया गया था कि multicopy plasmids की उपस्थिति की दर त्वरित उनि-1 तीसरी पीढ़ी के प्रतिरोध को प्रदान उत्परिवर्तनों cephalosporin ceftazidime. इन परिणामों से संकेत दिया कि multicopy plasmids एंटीबायोटिक प्रतिरोध के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है ।
यहाँ, हम एंटीबायोटिक प्रतिरोध की multicopy प्लाज्मिड-मध्यस्थता विकास की जांच करने के लिए विकसित की है कि विधि का एक विस्तृत वर्णन प्रस्तुत करते हैं । इस विधि तीन अलग कदम है: पहले, अध्ययन के तहत जीन की प्रविष्टि या तो एक multicopy प्लाज्मिड या मेजबान बैक्टीरिया के गुणसूत्र में । दूसरा, प्रयोगात्मक विकास का उपयोग (विकासवादी बचाव) के लिए अलग उपभेदों की क्षमता का आकलन करने के लिए चयनात्मक दबाव के अनुकूल । और तीसरा, आणविक आधार प्लाज्मिड अंतर्निहित डीएनए अनुक्रमण का उपयोग कर विकास और माता पिता के जीनोटाइप में व्यक्तिगत रूप से संदिग्ध उत्परिवर्तनों के पुनर्निर्माण का निर्धारण ।
अंत में, हालांकि प्रोटोकॉल यहां वर्णित एंटीबायोटिक प्रतिरोध के विकास की जांच के लिए डिज़ाइन किया गया था, एक तर्क है कि इस विधि आम तौर पर किसी भी multicopy में उत्परिवर्तनों द्वारा अधिग्रहीत नवाचारों के विकास का विश्लेषण उपयोगी हो सकता है प्लाज्मिड-एनकोडेड जीन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक नया आणविक जीवविज्ञान, प्रयोगात्मक विकास और गहरे डीएनए sequencing बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध के विकास में multicopy plasmids की भूमिका की जांच करने के लिए डिज़ाइन के संयोजन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम Instituto de Salud कार्लोस III द्वारा समर्थित किया गया था (योजना Estatal de i + D + मैं 2013-2016): अनुदान CP15-00012, PI16-00860, और CIBER (CB06/02/0053), सह यूरोपीय विकास क्षेत्रीय कोष द्वारा वित्त पोषित ‘ ‘ एक तरह से यूरोप को प्राप्त करने के लिए ‘ ‘ (ERDF) । जॅ मैड्रिड के क्षेत्र की सरकार के Atracción de talento कार्यक्रम द्वारा समर्थित है (2016-T1/बायो-1105) और स्पेनिश Ministerio de Economía के I + D Excelencia, Industria y Competitividad (2017-85056-P). एएसएम Instituto de Salud कार्लोस III (MS15/00012) सह से एक Miguel Servet फैलोशिप द्वारा समर्थित है यूरोपीय सामाजिक कोष द्वारा वित्त पोषित “अपने भविष्य में निवेश” (ESF) और ERDF ।
Materials
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
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