Prova il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico
Summary
Qui presentiamo un metodo sperimentale per testare il ruolo dei plasmidi multicopia nell’evoluzione della resistenza agli antibiotico.
Abstract
Plasmidi multicopia sono estremamente abbondanti nei procarioti, ma il loro ruolo nell’evoluzione batterica rimane capita male. Recentemente abbiamo dimostrato che l’aumento nel numero di copia del gene per cellula fornito dai plasmidi multicopia potrebbe accelerare l’evoluzione dei geni del plasmide-codificati. In questo lavoro, vi presentiamo un sistema sperimentale per testare la capacità di plasmidi multicopia di promuovere l’evoluzione. Utilizzando metodi di biologia molecolare semplice, abbiamo costruito un sistema di modello dove un gene di resistenza agli antibiotici può essere inserito in Escherichia coli MG1655, il cromosoma o su un plasmide multicopia. Usiamo un approccio sperimentale evoluzione di propagare i diversi ceppi sotto aumento delle concentrazioni di antibiotici e misuriamo la sopravvivenza delle popolazioni batteriche nel corso del tempo. La scelta della molecola antibiotica e il gene di resistenza è quindi che il gene solo può conferire resistenza attraverso l’acquisizione di mutazioni. Questo approccio “evolutivo salvataggio” fornisce un metodo semplice per verificare il potenziale dei plasmidi multicopia per promuovere l’acquisizione della resistenza agli antibiotico. Nel passaggio successivo del sistema sperimentale, le basi molecolari della resistenza agli antibiotico sono caratterizzate. Per identificare le mutazioni responsabili dell’acquisizione della resistenza agli antibiotico usiamo profonda sequenziamento del DNA dei campioni ottenuti da cloni e intere popolazioni. Infine, per confermare il ruolo delle mutazioni del gene sotto studio, ricostruirli in background parentale e testare il fenotipo di resistenza dei ceppi risultante.
Introduction
Resistenza agli antibiotici nei batteri è un problema di salute importante1. A un livello fondamentale, la diffusione della resistenza agli antibiotico nei batteri patogeni è un semplice esempio dell’evoluzione attraverso la selezione naturale2,3. In parole povere, l’uso di antibiotici genera la selezione di ceppi resistenti. Un problema chiave nella biologia evolutiva, pertanto, è di comprendere i fattori che influenzano la capacità delle popolazioni batteriche di evolvere la resistenza agli antibiotici. Esperimenti di selezione sono emerse come uno strumento molto potente per studiare la biologia evolutiva dei batteri, e questo campo ha prodotto incredibili intuizioni in una vasta gamma di problemi evolutivi4,5,6. In evoluzione sperimentale, popolazioni batteriche avviate da un unico ceppo parentale in serie sono attraversate in condizioni definite e strettamente controllate. Alcune delle mutazioni che si verificano durante la crescita di queste culture aumentare la forma fisica batterica, e questi diffondere attraverso le culture tramite la selezione naturale. Durante l’esperimento, campioni delle popolazioni sono periodicamente criogenicamente conservati per creare un record di fossili congelato non in evoluzione. Un ampio numero di approcci può essere utilizzato per caratterizzare in evoluzione di popolazioni batteriche, ma i due metodi più comuni sono saggi di fitness, che misura la capacità dei batteri evoluti per competere contro i loro lontani antenati e sequenziamento del genoma intero, che è utilizzato per identificare i cambiamenti genetici che l’adattamento in auto. A seguito di lavoro pionieristico di Richard Lenski e colleghi7,8, l’approccio standard in evoluzione sperimentale è stato quello di sfidare un numero relativamente piccolo di popolazioni replicare (in genere < 10) con adattamento a un nuovo sfida ambientale, come ad esempio nuove fonti di carbonio, la temperatura o un fago predatorio.
Infezioni causate da batteri resistenti agli antibiotici diventano un grosso problema quando la resistenza è abbastanza alta che non è possibile aumentare le concentrazioni di antibiotiche a livelli letali nei tessuti del paziente. I clinici sono quindi interessati a ciò che permette ai batteri di evolvere la resistenza ad alte dosi di antibiotico che si trovano sopra questa concentrazione di antibiotico di soglia, il punto di interruzione clinica. Come studiare sperimentalmente questo? Se un piccolo numero di popolazioni batteriche è sfidato con un’alta dose di antibiotico, come in uno stile di Lenski esperimento, quindi il risultato più probabile è che l’antibiotico guiderà tutte le popolazioni all’estinzione. Allo stesso tempo, se la dose di antibiotico utilizzato è bassa, sotto la concentrazione inibitoria minima (MIC) del ceppo parentale, allora è improbabile che popolazioni batteriche si evolveranno clinicamente rilevanti livelli di resistenza, soprattutto se resistenza comporta un costo grande. Un compromesso tra questi due scenari consiste nell’utilizzare un “salvataggio evolutivo” esperimento9,10,11. In questo approccio, un numero molto elevato di culture (in genere > 40) è contestato con dosi di antibiotici che aumentano nel tempo, in genere raddoppiando la concentrazione di antibiotica ogni giorno12. Il segno distintivo di questo esperimento è che qualsiasi popolazione che non si evolve la resistenza aumentata sarà guidato all’estinzione. La maggior parte delle popolazioni che si sono sfidate in questo modo saranno guidate estinte, ma una piccola minoranza persisterà evolvendosi elevati livelli di resistenza. In questa carta, indichiamo come questo disegno sperimentale può essere utilizzato per studiare multicopia plasmide contributo all’evoluzione della resistenza.
I batteri acquisire resistenza agli antibiotici attraverso due itinerari principali, le mutazioni cromosomiche e l’acquisizione di elementi genetici mobili, per lo più plasmidi13. Plasmidi gioca un ruolo chiave nell’evoluzione della resistenza agli Antibiotico, perché essi sono in grado di trasferire geni di resistenza tra i batteri da coniugazione14,15. Plasmidi possono essere divisi in due gruppi secondo la loro dimensione e biologia: “più piccoli”, con numero di alta copia per cellula batterica e “grandi”, con bassa copiare numero16,17. Il ruolo dei plasmidi grande nell’evoluzione della resistenza agli antibiotico è stata ampiamente documentato perché essi comprendono plasmidi coniugativi, che sono fattori chiave della diffusione di resistenza e resistenza multi tra batteri15. Piccoli plasmidi multicopia anche sono estremamente comuni in batteri17,18, ed essi spesso codice per geni di resistenza agli antibiotici19. Tuttavia, il ruolo dei piccoli plasmidi multicopia nell’evoluzione della resistenza agli antibiotico è stato studiato in misura minore.
In un recente lavoro, abbiamo proposto che plasmidi multicopia potrebbero accelerare l’evoluzione dei geni che portano aumentando i tassi di mutazione genica dovuta al maggior numero di copia del gene per cellula12. Utilizzando un modello sperimentale con Escherichia coli ceppo MG1655 e il β-lactamase gene blaTEM-1 è stato indicato che plasmidi multicopia accelerato il tasso di comparsa di TEM-1 mutazioni che conferiscono resistenza alla terza generazione ceftazidime cefalosporina. Questi risultati hanno indicato che i plasmidi multicopia potrebbero svolgere un ruolo importante nell’evoluzione della resistenza agli antibiotico.
Qui, presentiamo una descrizione dettagliata del metodo abbiamo sviluppato per studiare l’evoluzione multicopia plasmide-mediata della resistenza agli antibiotico. Questo metodo ha tre diverse fasi: primo, inserimento del gene in esame in un plasmide multicopia o il cromosoma del batterio ospite. In secondo luogo, utilizzare dell’evoluzione sperimentale (salvataggio evolutiva) per valutare il potenziale dei diversi ceppi di adattarsi alla pressione selettiva. E terzo, determinare la base molecolare sottostante plasmide-mediata evoluzione usando il DNA sequencing e ricostruendo le mutazioni sospetta individualmente nel genotipo parentale.
Infine, anche se il protocollo descritto qui è stato destinato per studiare l’evoluzione della resistenza agli Antibiotico, si può sostenere che questo metodo potrebbe essere generalmente utile per analizzare l’evoluzione delle innovazioni acquisite dalle mutazioni in qualsiasi multicopia gene di plasmide-codificati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presentiamo un nuovo protocollo che unisce la biologia molecolare, evoluzione sperimentale e sequenziamento del DNA profondo destinato per studiare il ruolo dei plasmidi multicopia nell’evoluzione della resistenza agli antibiotico nei batteri. Sebbene questo protocollo combina tecniche provenienti da diversi campi, tutti i metodi necessari per svilupparlo sono semplici e possono essere eseguiti in un laboratorio di microbiologia regolari. I passaggi più critici nel protocollo sono probabilmente la costruzione di cepp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dall’Instituto de Salud Carlos III (Plan Estatal de I + D + io 2013-2016): concede CP15-00012, PI16-00860 e CIBER (CB06/02/0053), co-finanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale ‘ un modo per raggiungere l’Europa ‘ (FESR). JAE è supportato dal programma Atracción de talento del governo della regione di Madrid (2016-T1/BIO-1105) e I + D Excelencia di spagnolo Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM è supportato da un Miguel Servet Fellowship da Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) co-finanziato dal Fondo sociale europeo The “Investiamo nel vostro futuro” (FSE) e del FESR.
Materials
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
References
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