抗生物質耐性の進化のマルチコピー プラスミドのロールのテスト
Summary
抗生物質耐性の進化でマルチコピー プラスミドの役割をテストするための実験方法をご紹介します。
Abstract
マルチコピー プラスミドは原核生物に非常に多いが、細菌の進化におけるそれらの役割のままかり。我々 は最近、マルチコピー プラスミッドによって指定されたセルあたり遺伝子コピー数の増加がプラスミド エンコード遺伝子の進化を加速させる可能性を示した。この作品は、マルチコピー プラスミドの遺伝子の進化を促進するための能力をテストする実験システムを提案する.分子生物学の単純なメソッドを使用して、抗生物質耐性遺伝子を大腸菌MG1655、染色体またはマルチコピー プラスミド上に挿入できるモデル システムを構築しました。抗生物質の濃度の増加の下で異なる系統を反映する実験的進化のアプローチを使用して、我々 は時間をかけて細菌集団の生存率を測定します。抗生物質分子と抵抗性遺伝子の選択は、遺伝子突然変異の買収を通じて抵抗を与えることができるだけので、です。この「進化レスキュー」アプローチは、マルチコピー プラスミドの抗生物質抵抗性の獲得を促進するための可能性をテストする簡単な方法を提供します。実験システムの次のステップでは、抗生物質耐性の分子基盤が特徴です。抗生物質耐性の獲得のための責任の突然変異を識別するために、我々 は全体の人口とクローンから得られた試料のディープの DNA シーケンス使用します。最後に、調査の下で遺伝子の変異の役割を確認する我々 は親の背景にそれらを再構築し、結果系統の抵抗の表現型をテストします。
Introduction
細菌の抗生の抵抗は重大な健康問題1です。基本的なレベルで病原細菌の抗生物質耐性の普及、自然淘汰の2,の3による進化の単純な例です。簡単に言えば、抗生物質の使用は、耐性菌の選択を生成します。進化生物学の重要な問題は、したがって、抗生物質への耐性を進化する細菌集団の能力に影響を与える要因を理解します。選択の実験は、細菌の進化生物学を調査するための非常に強力なツールとして浮上しているし、このフィールドは幅広い進化問題4,5,6に信じられないほどの洞察力を生産しています。実験的進化の 1 つの親株から開始された細菌集団が定義され、厳しく管理された条件の下で連続継代します。これらの文化の成長中に発生する突然変異のいくつかの増加細菌のフィットネス、これらは自然淘汰によって文化を介して 。実験では、人口のサンプルは非進化する冷凍化石レコードを作成する定期的に低温保持されます。細菌集団を進化を特徴付けるためのアプローチの広い数を使用できますが、2 つの最も一般的な方法は、フィットネスの試金、遠い祖先と全ゲノム配列が進化した細菌の競争力を測定ドライブの適応の遺伝の変更を識別するために使用されます。リチャード Lenski および同僚7,8で先駆的な仕事は、次の実験進化の標準的なアプローチはレプリケート人口の比較的小さい数に挑戦するされている (通常 < 10) 新しいへの適応に環境チャレンジ、新しい炭素源、温度、捕食性ファージなど。
抗生物質耐性菌によって引き起こされる感染症抵抗は患者の体内を致死量に抗生物質の濃度を高めることが可能だが十分に高いとき大きな問題になります。臨床医は細菌がこのしきい値抗生物質濃度臨床ブレークポイント上抗生物質の高用量への抵抗を進化することができる内容に興味があるため。これを実験的に研究する方法?細菌集団の数が少ないが、高用量の抗生物質の挑戦レンスキー スタイルのように実験、その後、最も可能性の高い結果は、抗生物質が絶滅の危機に個体群のすべてを駆動すること。同時に使用される抗生物質の投与量は、親株の最小発育阻止濃度 (MIC) を下回る場合、ない細菌の集団は、抵抗性の臨床的に関連するレベルを進化していく可能性が高い場合は特に抵抗には、大きな代償が伴います。これらの 2 つのシナリオ間の 1 つの妥協は、「進化レスキュー」実験9,10,11を使用します。このアプローチは文化の非常に大きい数で (通常 > 40) が時間をかけて増加、通常抗生物質の濃度を倍にして毎日12抗生物質の用量で挑戦します。この実験の特徴は、高められた抵抗を進化していない人口が絶滅に追い込まれることです。この方法でほとんどの個体群は絶滅し、駆動されるが、少数は、高レベルの耐性を進化させることによって保持されます。本稿では、この実験的なデザインを使用して抵抗性の進化にマルチコピー プラスミドの貢献を調査する方法を示す.
細菌は、2 つの主要ルート、染色体突然変異およびモバイル遺伝的要素、主プラスミド13の取得を通じた抗生物質に耐性を獲得します。プラスミドは、活用14,15による細菌の抵抗性遺伝子を転送することができるので抗生物質耐性の進化で重要な役割を再生します。プラスミドは彼らのサイズおよび生物学によると 2 つのグループに分けることができます:「小」、高コピー数細菌の細胞と「大」と低コピー数の16,17。抵抗と細菌15マルチ抵抗の普及の主要なドライバーである接合性プラスミドが含まれるために、抗生物質耐性の進化での大型プラスミドの役割を広く記載されています。小さなマルチコピー プラスミドも細菌17,18, 非常に一般的な彼らはしばしば抗生物質耐性遺伝子19のコードします。ただし、抗生物質耐性の進化で小さなマルチコピー プラスミドの役割より少ない程度に研究されています。
最近の作品ではマルチコピー プラスミドが高い遺伝子コピー セル12数による遺伝子突然変異率を増やすことによって彼らを運ぶ遺伝子の進化を加速させる可能性を提案します。大腸菌の菌株 MG1655 と β-ラクタマーゼ遺伝子blaTEM 1実験モデルを用いたマルチコピー プラスミド加速の第三世代に耐性 TEM 1 突然変異の出現率であることが示されました。セファロスポリン セフタジジム。マルチコピーのプラスミドがあります抗生物質耐性の進化で重要な役割を果たすことが示唆されました。
今回開発した手法の詳細な説明、マルチコピー プラスミド性抗生物質耐性の進化を調査します。このメソッドは 3 つの異なる手順: 調査マルチコピー プラスミッドまたはホストの細菌の染色体のどちらかの下で遺伝子の最初に挿入します。第二に、実験的進化 (進化救助) の選択的な圧力に適応するため別系統の可能性を評価するために使用します。そして第三に、DNA シークエンシングと親の遺伝子型で個別に疑いのある突然変異を再構成を用いたプラスミド性の進化の分子基盤を決定します。
最後に、ここで説明されているプロトコルは、抗生物質耐性の進化を調査するため設計されました、1 つ主張することがこのメソッドは一般に任意の複数部数の突然変異によって取得した技術革新の進化を分析し便利かもしれないプラスミド エンコード遺伝子。
Protocol
Representative Results
Discussion
分子生物学、実験進化マルチコピー プラスミド細菌の抗生物質耐性の進化の役割を調べるために考案ディープの DNA シーケンスを組み合わせた新しいプロトコルを提案します。このプロトコルは、さまざまな分野からの技術を結合がそれを開発するために必要なすべての方法は単純であり通常の微生物学実験室で実行することができます。プロトコルの最も重要な手順は、モデル システム系…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はセルバンテス デによって支えられたサラッド カルロス III (計画アジア デ私 + D + 私 2013-2016): CIBER (CB06/02/0053)、PI16-00860 CP15 00012 協調融資欧州開発地域基金 ‘ヨーロッパを達成する方法’ を付与 (ERDF)。在マドリード (2016-T1/バイオ-1105) と私の地域の政府のAtracción ・ デ ・ タレントプログラムに支えられて + スペイン Ministerio デ Economía、インドゥストリア y Competitividad (BIO2017-85056-P) の D Excelencia です。ASM セルバンテス ・ デ ・からミゲル サーブレット交わりに支えられてサラッド カルロス 3 世 (MS15/00012) の欧州社会基金の協調融資「あなたの未来への投資」(ESF) と ERDF。
Materials
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
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