Her presenterer vi en eksperimentell metode for å teste multicopy plasmider rolle i utviklingen av antibiotikaresistens.
Multicopy plasmider er svært rikelig i prokaryoter, men deres rolle i bakteriell utviklingen fortsatt dårlig forstått. Vi har nylig viste at økningen i genet kopi tall per celle fra multicopy plasmider kunne akselerere utviklingen av plasmider-kodet gener. I dette arbeidet presenterer vi en eksperimentell system for å teste muligheten for multicopy plasmider å fremme genet evolusjon. Bruke enkel molekylærbiologi metoder, bygget vi et modellsystem der en antibiotikaresistens genet kan settes inn i Escherichia coli MG1655, i kromosomet eller på en multicopy plasmider. Vi bruker en eksperimentell utviklingen tilnærming overføres de ulike stammene under økende konsentrasjoner av antibiotika og vi måle overlevelse av bakteriell befolkninger over tid. Valg av antibiotika molekylet og motstand genet er slik at genet kan bare tildele motstand gjennom oppkjøpet av mutasjoner. Denne “evolusjonære redde” gir en enkel metode for å teste potensialet i multicopy plasmider å fremme oppkjøpet av antibiotikaresistens. I neste trinn av eksperimentelle kjennetegnes molekylær baser av antibiotikaresistens. For å identifisere mutasjoner ansvarlig for anskaffelsen av antibiotikaresistens bruker vi dyp DNA sekvensering av prøver innhentet fra hele befolkninger og kloner. Til slutt, for å bekrefte rollen mutasjoner i genet under studien, vi rekonstruere dem i foreldrenes bakgrunnen og teste motstand fenotypen av de resulterende stammene.
Antibiotikaresistens i bakterier er store helsemessige problem1. På et grunnleggende nivå er spredning av antibiotikaresistens i patogene bakterier et enkelt eksempel på evolusjon ved naturlig utvalg2,3. Enkelt sagt, genererer bruk av antibiotika valg for resistente bakteriestammer. Et sentralt problem i evolusjonsbiologi, er derfor å forstå faktorene som påvirker evnen til bakteriell bestander å utvikle resistens mot antibiotika. Utvalg eksperimenter har dukket opp som et svært kraftig verktøy for å undersøke evolusjonsbiologi av bakterier, og dette feltet har produsert utrolige innsikt i en rekke evolusjonære problemer4,5,6. I eksperimentelle evolusjon, er bakteriell bestander startet fra en enkelt foreldrenes stamme serielt passaged under definerte og strengt kontrollert. Noen av mutasjoner som oppstår under veksten av disse kulturene øke bakteriell fitness, og disse spres gjennom kulturer ved naturlig utvalg. Under eksperimentet beholdes regelmessig cryogenically prøver av befolkningen for å opprette en ikke-utvikling frosne fossil posten. Et bredt antall tilnærminger kan brukes til å karakterisere utvikling bakteriell befolkninger, men de to vanligste metodene er fitness analyser, som måler evnen av utviklet bakterier for å konkurrere mot deres fjerne forfedre og hele genomet sekvensering, som er brukes til å identifisere genetiske endringer som stasjonen tilpasning. Etter pionerarbeid av Richard Lenski og kolleger7,8, standard tilnærmingen i eksperimentell utvikling har vært å utfordre et relativt lite antall Repliker populasjoner (vanligvis < 10) med å tilpasse seg en ny miljøbestemte utfordringen, som nye karbon kilder, temperatur eller en ROV phage.
Infeksjoner forårsaket av antibiotika resistente bakterier blir et stort problem når motstand er høy nok til at det ikke er mulig å øke antibiotikumet konsentrasjonene dødelige nivåer i pasienten vev. Klinikere er derfor interessert i hva gjør bakterier utvikle seg mot høye doser av antibiotika som er over denne terskelen antibiotika konsentrasjon, klinisk stoppunktet. Hvordan å studere dette eksperimentelt? Hvis et lite antall bakteriell populasjoner er utfordret med en høy dose av antibiotika, som en Lenski-stil er eksperimentet, så mest sannsynlig utfall at antibiotikaet vil drive alle befolkningen til utryddelse. Samtidig, hvis dosen av antibiotika som brukes er lav, under den minimale inhibitoriske konsentrasjonen (MIC) av foreldrenes belastningen, er det usannsynlig at bakteriell befolkningen vil utvikle seg klinisk relevante nivåer av motstand, særlig hvis motstand har en stor kostnad. En kompromiss mellom disse to scenariene er å bruke en «evolusjonære redde» experiment9,10,11. I denne tilnærmingen, et stort antall kulturer (vanligvis > 40) blir utfordret med doser av antibiotika som øker over tid, vanligvis ved å doble antibiotika konsentrasjon hver dag12. Kjennetegnet med dette eksperimentet er at en befolkning som ikke utvikles økt vil bli drevet til utryddelse. De fleste populasjoner som er utfordret på denne måten vil bli drevet utdødd, men en liten minoritet beholdes ved utvikler høye nivåer av motstand. I dette papiret viser vi hvordan denne eksperimentell design kan brukes å undersøke multicopy plasmider bidrag til utviklingen av motstand.
Bakterier erverve resistens mot antibiotika gjennom to viktigste ruter, chromosomal mutasjoner og oppkjøpet av mobile genetiske elementer, hovedsakelig plasmider13. Plasmider spille en nøkkelrolle i utviklingen av antibiotikaresistens fordi de er i stand til å overføre motstand gener mellom bakterier ved Bøyning14,15. Plasmider kan deles inn i to grupper i henhold til deres størrelse og biologi: “små”, med høy kopi nummer per bakterielle celler og “stor”, med lav kopiere nummer16,17. Rollen til store plasmider i utviklingen av antibiotikumet motstand har blitt grundig dokumentert fordi de inneholder konjugerbart plasmider, som viktige drivere av formidling av motstand og multi motstand blant bakterier15. Små multicopy plasmider er også svært vanlig bakterier17,18, og de koden ofte for antibiotikaresistens gener19. Men har rollen som små multicopy plasmider i utviklingen av antibiotikumet motstand vært studert i mindre grad.
I en nylig arbeid foreslått vi at multicopy plasmider kunne akselerere utviklingen av gener de bærer ved å øke gen mutasjon priser på grunn av høyere genet kopi per celle12. Bruke en eksperimentell modell med E. coli belastning MG1655 og β-lactamase gene blaTEM-1 ble det vist at multicopy plasmider akselerert frekvensen av utseendet på TEM-1 mutasjoner overdragelse motstand mot den tredje generasjonen cephalosporin ceftazidime. Disse resultatene indikerte at multicopy plasmider kan spille en viktig rolle i utviklingen av antibiotikaresistens.
Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av metoden vi har utviklet å undersøke multicopy plasmider-mediert utviklingen av antibiotikaresistens. Denne metoden har tre ulike trinn: først, innsetting av genet under studien i en multicopy plasmider eller kromosomet av verten bakterier. Andre bruk av eksperimentelle evolusjon (evolusjonære redning) å vurdere potensialet i forskjellige stammene til å tilpasse seg seleksjonspress. Og tredje, bestemme molekylær grunnlaget underliggende plasmider-mediert utviklingen med DNA sekvensering og rekonstruere mistenkt mutasjoner individuelt i foreldrenes genotype.
Til slutt, selv om protokollen beskrevet her ble utformet å undersøke utviklingen av antibiotikaresistens, man kan hevde at denne metoden kunne vanligvis nyttig å analysere utviklingen av innovasjoner kjøpt av mutasjoner i alle multicopy plasmider-kodet genet.
Vi presenterer en ny protokoll kombinerer molekylærbiologi, eksperimentelle evolusjon og dyp DNA sekvensering utformet å undersøke rollen multicopy plasmider i utviklingen av antibiotikaresistens i bakterier. Selv om denne protokollen kombinerer teknikker fra ulike felt, alle metoder å utvikle den er enkel, og kan utføres i en vanlig mikrobiologi. De viktigste trinnene i protokollen er sannsynligvis byggingen av modellen systemet stammer og gjenoppbygging av mutasjoner observert etter eksperimentelle utviklingen (so…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av i Instituto de Salud Carlos III (planlegge Estatal de jeg + D + jeg 2013-2016): gir CP15-00012, PI16-00860 og CIBER (CB06/02/0053), delfinansiert av European utvikling regionale Fund ” en måte å oppnå Europa ” (ERDF). JAE støttes av Atracción de talento programmet av regjeringen i regionen Madrid (2016-T1/BIO-1105) og jeg + D Excelencia av den spanske Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM støttes av et Miguel Servet fellesskap fra Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) co-finansiert av The European Social Fund “Investering i fremtiden” (ESF) og ERDF.
Thermocycler | BioRad | C1000 | |
Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
Incubator | Memmert | UF1060 | |
Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
96-well plates | Falcon | 351172 | |
LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |