Проверка роли применим плазмид в эволюции антибиотикорезистентности
Summary
Здесь мы представляем экспериментальный метод для проверки роли применим плазмид в эволюции к антибиотикам.
Abstract
Применим плазмиды прокариот чрезвычайно изобилуют, но их роль в бактериальных эволюция по-прежнему осознаются. Недавно мы показали, что увеличение числа копии гена в ячейке, представленной применим плазмид может ускорить эволюцию генов плазмида кодировке. В этой работе мы представляем экспериментальная система для тестирования применим плазмид способность содействовать эволюции ген. С помощью простых молекулярной биологии методов, мы построили модель системы, где ген устойчивости к антибиотикам может быть вставлен в Escherichia coli MG1655, хромосомы или на применим плазмиды. Мы используем подход экспериментальной эволюции для распространения различных штаммов под все возрастающей концентрации антибиотиков и мы измеряем выживания бактериальных популяций с течением времени. Выбор антибиотиков молекулы и сопротивление гена — так, что ген может лишь придать сопротивление путем приобретения мутаций. Этот подход «эволюционная спасения» предоставляет простой метод для проверки потенциала применим плазмиды для содействия приобретению устойчивости к антибиотикам. На следующем шаге экспериментальной системы характеризуются молекулярные основы устойчивости к антибиотикам. Для выявления мутаций отвечает за приобретение антибиотикорезистентности мы используем глубокая секвенирования ДНК образцов, полученных из всего населения и клоны. Наконец чтобы подтвердить роль мутаций в гене под исследование, мы восстановить их в родительский фон и проверить сопротивление фенотип результате штаммов.
Introduction
Устойчивость к антибиотикам у бактерий является серьезной медицинской проблемой1. На фундаментальном уровне распространение устойчивости к антибиотикам болезнетворных бактерий является простой пример эволюции путем естественного отбора2,3. Проще говоря, использование антибиотиков генерирует выбор для устойчивых штаммов. Ключевой проблемой в эволюционной биологии, поэтому, необходимо понять, какие факторы, которые влияют на способность развиваться устойчивость к антибиотикам бактериальных популяций. Выбор эксперименты появились как очень мощный инструмент для расследования эволюционной биологии бактерий, и это поле дало невероятные идеи в широкий спектр эволюционных проблемы4,5,6. В экспериментальной эволюции бактериальных популяций, инициированных из одного родительского штамма серийно пассированной определенных и жестко контролируемых условиях. Некоторые мутации, происходящие во время роста этих культур увеличения бактериальной фитнес, и они распространяются через культур путем естественного отбора. В ходе эксперимента образцы населения периодически криогенно сохраняются для создания не развивается замороженных окаменелостей. Широкий ряд подходов может использоваться для характеристики развивается бактериальных популяций, но наиболее распространенными методами являются два фитнес анализов, которые измеряют развивались бактерий способность конкурировать против их далеких предков и всего генома, что используется для идентификации генетические изменения что адаптация привода. После новаторскую работу Ричард Ленский и коллеги7,8, стандартный подход в экспериментальной эволюции был бросить вызов сравнительно небольшое количество реплицировать населения (обычно < 10) с адаптации к новой экологические проблемы, например новых источников углерода, температуры или хищных ФАГ.
Инфекции, вызванные устойчивых к антибиотикам бактерий стать большой проблемой, когда сопротивление является достаточно высоким, что это не возможно для увеличения концентрации антибиотиков для смертельными уровнями в тканях пациента. Поэтому врачи заинтересованы в что позволяет бактериям развиваться сопротивления для высоких доз антибиотиков, которые превышают этот порог концентрации антибиотиков, клинической точки останова. Как учиться это экспериментально? Если небольшое количество бактериальных популяций оспариваются с высокой дозы антибиотика, как в стиле Ленски эксперимент, то наиболее вероятный результат является что антибиотик будет диск все населения к вымиранию. В то же время если доза антибиотика, который используется низкий, ниже минимальной ингибирующее концентрации (MIC) штамма родителей, то маловероятно что бактериальных популяций будет развиваться клинически значимых уровней сопротивления, особенно если сопротивление влечет за собой большие издержки. Один компромисс между этими двумя сценариями заключается в использовании10,9,эксперимент «эволюционная спасения»11. В этом подходе, очень большое количество культур (обычно > 40) оспаривается с дозы антибиотиков, которые увеличивают над временем, обычно путем удвоения концентрации антибиотиков каждый день12. Отличительной чертой этого эксперимента является, что население, которое не развиваться повышенное сопротивление будет управляться на вымирание. Большинство населения, которые оспариваются таким образом будет определяться вымерли, но незначительное меньшинство будет сохраняться меняющимися высокий уровень сопротивления. В этой статье мы покажем, как этот экспериментальный дизайн может использоваться для изучения применим плазмида вклад в развитие сопротивления.
Бактерии приобретают устойчивость к антибиотикам через два основных маршрутов, хромосомных мутаций и приобретение мобильных генетических элементов, главным образом плазмид13. Плазмиды играть ключевую роль в эволюции антибиотикорезистентности, потому что они способны переносить гены резистентности бактерий путем конъюгации14,15. Плазмиды можно разделить на две группы в зависимости от их размера и биология: «маленькие», с высоким копии номер в бактериальной клетке и «большой», с низкой скопировать номер16,17. Роль крупных плазмид в эволюции антибиотикорезистентности был хорошо документированы, потому что они включают сопряженных плазмиды, которые являются ключевыми факторами распространения сопротивления и сопротивления multi среди бактерий15. Малые применим плазмиды также чрезвычайно распространены в бактерии17,18, и они часто код для генов антибиотикорезистентности19. Однако в меньшей степени была изучена роль малых применим плазмид в эволюции антибиотикорезистентности.
В недавней работе мы предложили, что применим плазмид может ускорить эволюцию генов, которую они несут путем увеличения скорости мутации гена из-за большего числа копии гена в ячейке12. С штамм E. coli MG1655 и β-лактамаз гена блаТЭМ-1 с использованием экспериментальной модели было показано, что применим плазмид ускорить темпы появления мутаций ТЭМ-1, присвоении сопротивление третьего поколения Цефтазидим цефалоспоринов. Эти результаты показали, что применим плазмиды могут играть важную роль в эволюции к антибиотикам.
Здесь мы представляем подробное описание метода, мы разработали расследовать применим при посредничестве плазмида эволюции к антибиотикам. Этот метод имеет три различных этапа: во-первых, включение гена изучается в применим плазмида или хромосому бактерии хозяина. Во-вторых использование экспериментальной эволюции (эволюционной спасения) оценить потенциал различных штаммов адаптироваться к селективного давления. И в-третьих, определение молекулярные основы, лежащие в основе плазмид опосредованной эволюции, с помощью ДНК секвенирования и реконструкции подозреваемых мутации индивидуально в родительский генотипа.
Наконец хотя для изучения эволюции антибиотикорезистентности, был разработан протокол, описанные здесь, можно утверждать, что этот метод может быть вообще полезным для анализа эволюции инноваций, приобретена мутации в любой multicopy кодировке плазмид ген.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представляем новый протокол, молекулярной биологии, экспериментальной эволюции и глубокой секвенирования ДНК, предназначенные для расследования роли применим плазмид в эволюции к антибиотикам у бактерий. Хотя этот протокол сочетает в себе методы из разных областей, все методы, нео…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Instituto de Salud Карлоса III (план Estatal де я + D + я 2013-2016 гг.): гранты, CP15-00012, PI16-00860 и CIBER (CB06/02/0053), финансируется совместно Европейским фондом регионального развития ” способ достижения Европы ” (ERDF). JAE поддерживается Atracción де Таленто программы правительства региона Мадрид (2016-T1/био-1105) и I + D Джубая испанской Ministerio де Economía, Industria y развитию (BIO2017-85056-P). ASM поддерживается Мигель Сервет стипендий от Институту Salud Карлоса III (MS15/00012) финансируется Европейским социальным фондом «Инвестиции в ваше будущее» (ЕСФ) и ЕФРР.
Materials
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
References
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
- Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
- Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
- Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
- Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
- Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
- San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
- Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
- Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
- Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
- San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
- Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d’Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
- Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
- . . Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , (2009).
- Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
- Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
- Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
- Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).
