라이브 창 꼬마 선 충 에 Lysosomal Alkalinization 평가
Summary
C. 선 충 pH에 민감한 중요 한 염료 5 (6)-카-를 사용 하 여 2′, 7′-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)의 소장에 lysosomal 산의 손실을 조사 하는 단계별 가이드
Abstract
선 충 류 꼬마 선 충 (C. 선 충) 널리 장 수 및 발달 경로 연구 하는 데 사용 되는 모델 시스템입니다. 이러한 연구는 동물, 앞으로 고 역 유전자 분석, 붙일 레이블된 생성 단백질의 상대적 용이성 및 초기에 microinjected도 수 형광 염료의 사용 능력의 투명도 의해 촉진 된다 배아 세포 세포 (예 9-diethylamino-5 H-benzo (a) phenoxazine-5-1 및 (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-를 그것의 음식 (E. 콜라이 긴장 OP50)에 법인 또는 [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron)입니다. 여기, 선물이 장 리소좀 얼룩 형광 pH에 민감한 염료를 사용 하 여 라이브 벌레에 lysosomal 산에서 동적, 생리 적 변화를 영상 판독을 제공. 이 프로토콜 lysosomal pH를 측정 하지 않습니다 하지만 오히려 lysosomal 산 성도에 관련 된 생리 적 변화를 평가 하는 신뢰할 수 있는 방법을 설정 하는 것을 목표로. cDCFDA는 형광 fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (cDCF) 가수분해 시 세포내 esterases 변환 되는 셀 permeant 화합물 이다. 리소좀 안에 Protonation cDCF 어디 축적이 세포에서 트랩 합니다. 4.8의 그것의 낮은 pKa 때문이 염료는 효 모에는 pH 센서로 사용 되었습니다. 여기에 장 리소좀의 산도 평가 하기 위해 음식 보충으로 cDCFDA 사용 하 여 설명 C. 선 충. 이 기술은 살아있는 동물, alkalinizing 리소좀의 검출에 대 한 허용 하 고 노화와 autophagy, lysosomal 속에 대 한 연구를 포함 하는 실험적인 응용 프로그램의 광범위 한 범위를 하고있다.
Introduction
단백질의 외관은 진 핵 세포1,2,3, 그리고 대형의 생각 된다 세포 노화4 의 원리 드라이버 중에 노화의 각 인 될 널리 허용 , 5 , 6 , 7. 나이, 세포로 단백질 놓을 장애인, 단백질 집계에 증가로 이어지는 성장 증거가 있다. 세포 노화에 베이스의 붕괴 autophagy8 프로테아좀 중재 단백질 저하9의 장애를 포함 한다. 마지막으로, 돌이킬 수 없는 단백질 산화 단백질 놓을10더 혼란, 오래 된 세포에서 증가 된다.
Autophagy 처음 손상 된 단백질의 대량 저하에 대 한 비 선택 과정이 될 생각 하지만 최근 연구 결과 그 autophagy는 단백질 집계 되지 않은 역 기능 세포의 놓을에 매우 선택적 표명 의무가 다른 단백질 정리 메커니즘11통해 저하. Autophagy 과정에서 손상 되 고 집계 된 단백질은 autophagosome 라는 이중 막 소포에 격리 됩니다. 이 autophagosome 다음 리소좀, 라는 산 성 세포와 autophagosome 화물12의 저하에 이르게 퓨즈. Lysosomes autophagic 통로의 끝점을 나타내는 고 막 수리, transcriptional 제어 및 영양소 감지; 같은 다른 세포질 과정에 참여 세포질 항상성 (참고 13에서 검토 한 결과)에 그들의 중앙된 역할을 강조 합니다. 여러 연구 lysosomal 함수에는 연령에 따라 감소와 다양 한 신경 장애13사이 연결 표시. 일관 되 게, 이전 셀에 lysosomal 기능을 복원 노화 관련 고기14,15의 발병을 지연 수 있습니다. Intralumen 환경 구성의 연구 이전 셀에 lysosomal 기능의 붕괴 lysosomal 프로 테아 제16의 생산에 있는 감소 때문에 하지는 것이 좋습니다. 또는, intralysosomal 산, 그것의 효소 활동의 중요 한 요구의 손실 리소좀 중재 베이스17드롭 기초 수 있습니다 제안 되었습니다. 이 가설을 찾아보기 수 있도록, 시 약 및 복제 하 고 일관 된 방식으로 라이브 셀에 lysosomal pH에서 동적인 변화를 조사 하는 프로토콜 개발에 필수적 이다.
C. 선 충 의 창 자 벌레에서 주요 대사 조직 이며 조직의 항상성 및 수명의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. 우리는 변화를 평가 하기 위해 분석 실험 개발 어떻게 리소좀 중재 하는 베이스를 결정 하는 벌레의 장 리소좀의 루멘의 산 성도에 노화에 기여. PH에 민감한 fluorophores에서에서 사용 된 이전 C. 선 충 장 리소좀을 표시, 하지만 아직 lysosomal pH vivo에서18. 에 있는 작은 증가 감지할 수 있는 성공적인 프로토콜을 설정 하는 노력 되지 않았습니다. 여기, 우리 OP50 음식으로 pH에 민감한 fluorophore (cDCFDA)를 통합 하는 간단 하 고 편리한 먹이 프로토콜을 사용 하 여 C. 선 충 의 장 셀에 lysosomal 산 성도의 손실을 감지 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
노화, 세포 및 분자 이벤트의 다양 한 기여 생활사 특성 및 유전적 요인에 의해 영향을 받습니다. 우리의 최근 연구22 생식 주기 lysosomal pH 역학의 규제를 통해 소마의 피트 니스 조절에 중요 한 역할을 건의 한다. 우리는 동물에 산 성 리소좀 보장 v ATPase 전사의 upregulation에 의해 적극적으로 재현 하는 동안 그 중재 lysosomal 베이스 승진은 보여주었다. 복제, v ATPase 식 상품의 끝 리소…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 긴장, 자연과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 꼬마 유전학 센터 및 캐나다 재단 혁신 (CFI)에 대 한 자금에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리 박사 Exing 왕 (부 교수 감독, 광학 이미징 시설 뿐만 아니라 Lizhen 첸 박사 (셀 시스템의 부 및 해부학, UT 건강 샌 안토니오) 모든 선 충 C. 실험에 대 한 그녀의 실험실 시설의 무제한 사용 허용에 대 한 감사 하 고 싶습니다. UT 건강 샌 안토니오)를 통해 confocal 현미경 검사 법. 우리 또한 박사 마 이런 Ignatius 지원 및 비디오 촬영을 촉진 하기 위하여 격려를 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
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