腸の生きている線虫のライソゾーム アルカリ化を評価します。
Summary
PH に敏感な重要な染料 6 – カルボキシ – を使用して 2′, 7′-ジクロルフルオレッセン アセテート (cDCFDA) のc. の elegansの腸のライソゾーム酸性度の損失をプローブするステップ バイ ステップ ガイド
Abstract
線虫線虫(C. elegans) は、長寿と発達経路の研究に広く使用されているモデル システムです。このような研究は動物、転送し逆遺伝学的アッセイ、生成の蛍光に分類された蛋白質の相対的な容易さと初期に microinjected することができますいずれか蛍光染料の使用能力の透明物によって促進されます。胚、または細胞細胞器官 (例えば9-ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル-5 H-ベンゾ (a) 誘導 5-1 と (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-イル-活版} – N は – のラベルにその食品(大腸菌 OP50)に組み込まれました。[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron)。今回腸内リソソームを汚れ蛍光 pH 感受性色素の使用ライブ ワームのライソゾーム酸性度の動的な生理学的な変更のビジュアルの読み出しを提供します。このプロトコルはリソソームの pH を測定しないが、むしろライソゾーム酸性度の生理学的な関連語句を評価する信頼性の高い方法を確立することを目的と。cDCFDA は細胞内のエステラーゼによって加水分解時に蛍光蛍光 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (cDCF) に変換はセル側の透過物化合物です。リソソーム内のプロトン化それが蓄積する場所、これらのオルガネラの cDCF をトラップします。4.8 その低い pKa、ためこの染料は、酵母の pH センサーとして使用されています。ここで腸内リソソーム内の酸性度を評価するために栄養補助食品として cDCFDA の使用を説明線虫。この技術は生きている動物,に取って代わるリソソームの発見が可能、老化, オートファジー, およびリソソーム器官に関する研究を含む実験的アプリケーションの広い範囲を持っています。
Introduction
タンパク質凝集体の外観広く認められる真核細胞1,2,3と細胞老化4原則ドライバーの中に思想が形成の高齢化の特徴,5,6,7. 年齢を細胞、タンパク質の異化が障害、タンパク質凝集の増加につながる成長証拠があります。老化細胞における蛋白質分解の破綻には、プロテアソームを介したタンパク質分解9と同様、オートファジー8の障害が含まれます。最後に、古い細胞の増加は不可逆的なタンパク質の酸化タンパク質異化10をさらに損なうこと。
Autophagy は当初一括劣化損傷を受けたタンパク質の非選択性プロセスであると考えられたが、最近の研究は、オートファジーはタンパク質凝集体とは細胞小器官の機能不全の非常に選択が示されています。他の蛋白質のクリアランス機構11による特性劣化を受けやすい。オートファジーのプロセス中に破損したと集計されたタンパク質は、オートファゴソームと呼ばれる二重膜の小胞に隔離します。このオートファゴソームは、オートファゴソーム貨物12の劣化につながる、リソソームと呼ばれる酸性の細胞内小器官と融合します。リソソーム オートファジー経路のエンドポイントを表し、細胞膜修復、転写調節、栄養リモートセンシングなど別の細胞プロセスに参加(文献 13 見直し) のホメオスタシスで彼らの中心的な役割を強調します。いくつかの研究は、ライソゾーム機能、年齢依存的な低下と様々 な神経変性疾患13間の関連を示しています。一貫して、古い細胞のライソゾームの機能を復元すると、高齢化に関連した表現14,15の発症を遅らせることができます。Intralumen 環境の組成の研究では、古い細胞のライソゾームの機能の崩壊はリソソームタンパク16の生産の減少のためではないことを示唆しています。また、intralysosomal 酸味、その酵素活性の重要な要件の損失可能性がありますリソソームを介したタンパク質分解17でドロップの根底にあることが提案されている.この仮説を検証することができる、試薬およびレプリケート可能で一貫性のある方法で生きた細胞のライソゾーム pH のダイナミックな変化をプローブするためのプロトコルの開発が不可欠です。
線虫 c. エレガンスの腸みみずの主要な代謝組織であり、全身の恒常性と寿命の重要な調節因子。変化を評価するアッセイを開発したどのようにリソソームを介したタンパク質分解を決定するワームの腸内リソソーム内腔の酸性度で高齢化に貢献します。Hasn’t されてまだ、体内ライソゾーム pH18.の小さい増加を検出する成功したプロトコルを確立する努力が pH に敏感な fluorophores が付いては、腸内のリソソームをマークする線虫で従来使用されてきた、ここでは、OP50 食品に pH に依存した蛍光体 (cDCFDA) が組み込まれています簡単で便利な餌プロトコルを使用してc. の elegansの腸の細胞のライソゾーム酸性度の損失を検出する使用できるプロトコルを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
高齢化に貢献するさまざまな細胞および分子イベント生活史特性と遺伝的要因によって影響を受けます。私たちの最近の研究22では、生殖周期がライソゾーム pH の動態の調節を介して相馬のフィットネスの制御において重要な役割を果たしていることを示唆しています。V ATPase の転写は、順番により、酸性リソソームのアップレギュレーションによって動物を積極的に再現?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
系統、自然科学工学研究会議 (レベル) に線虫の遺伝学センターとカナダ財団の資金調達の革新 (CFI) のために感謝したいと思います。博士 Exing 王 (アソシエイト ・ ディレクター、光イメージング施設と同様、博士 Lizhen 陳 (細胞工学システム、解剖学、UT 健康サン ・ アントニオ) すべての線虫の実験のための彼女の研究室設備の無制限使用を許可するために感謝したいと思います、ユタ州健康サン アントニオ) 共焦点顕微鏡による援助のため。サポートおよびビデオ撮影を容易にするために奨励を提供するため博士マイロン イグナチオに感謝も申し上げます。
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
References
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
- Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson’s disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
- Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?. Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
- Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
- Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
- Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington’s disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
- Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
- Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age?. Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
- Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
- Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
- Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. 유전학. 207 (1), 83-101 (2017).
- Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
- Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
- Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
- Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
- Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
- Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
- Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
- Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).
