के रूप में आनुवंशिक मानव रोग के साथ जुड़े वेरिएंट के लिए खुला हो शुरू हो, यह तेजी से करने के लिए सिस्टम के साथ जो तेजी से उन पहचान वेरिएंट के जैविक महत्व का मूल्यांकन विकसित महत्वपूर्ण होता जा रहा है । इस प्रोटोकॉल महिला अर्धसूत्रीविभाजन मैं माउस अंडाणुओं का उपयोग कर के दौरान मानव जीन समारोह के मूल्यांकन के लिए तरीकों का वर्णन ।
भ्रूण aneuploidy मानव में बांझपन का प्रमुख आनुवंशिक कारण है । इन घटनाओं के अधिकांश महिला अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान शुरू, और हालांकि सकारात्मक मातृ आयु के साथ संबंधित, अकेले उंर हमेशा एक aneuploid भ्रूण पैदा करने के जोखिम का पूर्वानुमान नहीं है । इसलिए, जीन वेरिएंट oogenesis के दौरान गलत गुणसूत्र अलगाव के लिए खाते में हो सकता है । यह देखते हुए कि मानव अंडाणुओं के लिए उपयोग अनुसंधान प्रयोजनों, परख की एक श्रृंखला के लिए सीमित है अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान मानव जीन समारोह का अध्ययन मैं माउस अंडाणुओं का उपयोग कर विकसित किया गया । सबसे पहले, दूत आरएनए (mRNA) जीन और ब्याज की जीन संस्करण के दौर में microinjected मैं गिरफ्तार माउस अंडाणुओं हैं । अभिव्यक्ति के लिए समय की अनुमति के बाद, अंडाणुओं तुल्यकालिक meiotic परिपक्वता में जारी अर्धसूत्रीविभाजन मैं पूरा कर रहे हैं । इस तरह के ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (Gfp) के रूप में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के एक अनुक्रम के साथ mRNA टैगिंग द्वारा, मानव प्रोटीन के स्थानीयकरण phenotypic परिवर्तन के अलावा मूल्यांकन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, लाभ या समारोह की हानि प्रयोगात्मक शर्तों कि जीन उत्पाद को चुनौती meiotic त्रुटियों को ठीक स्थापित करके जांच की जा सकती है । हालांकि इस प्रणाली oogenesis के दौरान मानव प्रोटीन समारोह की जांच में लाभप्रद है, परिणामों की पर्याप्त व्याख्या दिया जाना चाहिए कि प्रोटीन अभिव्यक्ति अंतर्जात स्तर पर नहीं है और, जब तक के लिए नियंत्रित (यानी खटखटाया बाहर या नीचे), murine homologs भी सिस्टम में मौजूद हैं ।
बांझपन एक शर्त है कि प्रजनन आयु 1के मानव आबादी का 10-15% को प्रभावित करता है, जिसमें से लगभग एक आधा चिकित्सा उपचार 2की तलाश है । हालांकि बांझपन के एटियलजि विविध है और कई मामलों में multifactorial, मनुष्यों में सबसे आम आनुवंशिक विषमता भ्रूण aneuploidy 3है । Aneuploidy को किसी कक्ष में गुणसूत्रों की सही संख्या के विचलन (या तो लाभ या हानि) के रूप में परिभाषित किया गया है । मानव भ्रूण में aneuploidy की घटना आम है और उन्नत मातृ आयु 4,5के साथ बढ़ जाती है । चार यादृच्छिक नियंत्रित परीक्षण केवल chromosomally सामांय (euploid) गर्भाशय हस्तांतरण के लिए भ्रूण के चयन के लाभ पर प्रकाश डाला है क्योंकि इस रणनीति में वृद्धि आरोपण दरों में हुई, कम गर्भपात दर और एक छोटे समय के लिए गर्भावस्था को प्राप्त करने 6,7,8,9. इसलिए, मानव aneuploidy के एटियलजि को समझना सहायतापूर्ण प्रजनन में महत्वपूर्ण निहितार्थ हो सकते हैं ।
हालांकि पूर्व आरोपण aneuploidies के लिए आनुवंशिक परीक्षण बांझपन उपचार, कैसे aneuploidies उत्पत्ति अभी भी कमी है की एक पूरी तरह से समझ में लाभकारी है । यह व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते है कि वहां meiotic aneuploidies का एक सकारात्मक संबंध है (gamete उत्पादन के दौरान उत्पंन) और मातृ आयु, तथापि, कुछ महिलाओं को भ्रूण aneuploidy दरों कि उनके दिए उंर के लिए मतलब दर से विचलित उपस्थित 4। इन मामलों का सुझाव है कि अकेले उंर हमेशा एक aneuploid भ्रूण पैदा करने के जोखिम के पूर्वानुमान नहीं है । अंय कारकों भ्रूण aneuploidy, जैसे जीन वेरिएंट के जोखिम को बढ़ाने में एक भूमिका निभा सकता है ।
oocyte अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान aneuploidy करने के लिए एक जीन संस्करण के संभावित योगदान की जांच का एक महत्वपूर्ण पहलू को तेजी से meiotic जीन समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रणाली डिजाइन है । नैतिक बाधाओं और सीमित पहुंच के कारण, यह मानव अंडे का उपयोग कर इन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए अव्यावहारिक है । इन मुद्दों माउस अंडाणुओं का उपयोग करके दरकिनार किया जा सकता है, और यहां परख की एक श्रृंखला के लिए अर्धसूत्रीविभाजन मैं वर्णन कर रहे है के दौरान मानव जीन समारोह का आकलन । microinjecting दूत आरएनए (mRNA) ब्याज के जीन संस्करण के लिए कोडिंग के द्वारा, माउस अंडे में मानव प्रोटीन का स्थानीयकरण visualized किया जा सकता है और अगर जंगली प्रकार के अस्थानिक अभिव्यक्ति और रूपांतरित मानव प्रोटीन परिणाम निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया किसी भी phenotypic परिवर्तन है कि aneuploidy के लिए नेतृत्व कर सकता है । इन phenotypes microtubules में वृद्धि है कि बहन kinetochore के लिए अनुचित और अर्धसूत्रीविभाजन मैं के metaphase पर गुणसूत्र संरेखण समर्थन अक्षमता को देते शामिल हैं । महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल दोनों लाभ और समारोह के नुकसान की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों की स्थापना के द्वारा आनुवंशिक वेरिएंट ऐसी धुरी निर्माण और गुणसूत्र संरेखण के रूप में oocyte अर्धसूत्रीविभाजन में महत्वपूर्ण घटनाओं को चुनौती देने के लिए 10.
रोग के साथ जुड़े मानव आनुवंशिक वेरिएंट की तेजी से और बढ़ती पहचान की वजह से, यह आवश्यक है कि प्रणालियों उनके जैविक महत्व का मूल्यांकन करने के लिए स्थापित कर रहे हैं । मानव अर्धसूत्रीविभाजन में प्रोटीन स?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम अमेरिकी प्रजनन चिकित्सा के लिए सोसायटी से एक अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और चार्ल्स और Johanna बश मेमोरियल फंड से Rutgers में, कृष्णसिंह A.L.N. को ंयू जर्सी के राज्य विश्वविद्यालय N.I.H. (F31 HD0989597) से एक अनुदान द्वारा समर्थित था ।
0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
Ampicillin | VWR | AA0356 | |
Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
CO2 tank | For incubator | ||
Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
MG132 | Selleckchem | S2619 | |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
N2 tank | for antivibration table | ||
Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
Slide Warmer | any standard model | ||
Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
Stereomicroscope | any standard model | ||
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |