マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私
Summary
人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。
Abstract
異数性胚は人間の不妊の主要な遺伝的原因です。これらのイベントのほとんどが女性の減数分裂の間としています、時代だけでが常に異数性胚の生成の危険性の予測ではないとはいえ、母親の年齢との相関します。したがって、遺伝子変異は卵形成中に不適切な染色体分配を考慮可能性があります。人間の卵子へのアクセスが研究目的に限られていることを考える私マウス卵母細胞減数分裂の間人間遺伝子の働きを研究するアッセイのシリーズが開発されました。まず、興味の遺伝子の変異と遺伝子のメッセンジャー RNA (mRNA)、前期私逮捕マウス卵母細胞に microinjected します。式のための時間を許可すると後、卵子は同期的に成熟減数分裂を完了するために放出される私。緑色蛍光タンパク質 (Gfp) などの蛍光レポーターのシーケンスを持つ mRNA をタグによって表現型の変化に加えて人間蛋白質のローカリゼーションを評価できます。たとえば、ゲインまたは機能の損失は、減数分裂エラーを修正する遺伝子プロダクトを挑戦実験の条件を確立することによって調べることができます。蛋白質の表現は内因性のレベルでないことを考えると、(すなわちノック制御しない限り、結果の適切な解釈を行わなければならないこのシステムはとりこませた人間蛋白質機能の調査に有利であるが、うち上下)、マウスのホモログがシステムに存在も。
Introduction
不妊症は、生殖年齢の1、そこからほぼ半分を求める医療2人の人口の 10-15% に影響を与える条件です。不妊症の病因は多様であるが、多因子の多くの場合、人間の最も一般的な遺伝的異常は異数性胚3です。異数性は、細胞内の染色体の正しい数の偏差 (ゲインまたはロス) として定義されます。ヒト胎芽における異数性の現象は、一般的な高齢出産4、5と増加します。この戦略の結果、増加注入率、流産率の低下と時間の短縮のため子宮の転送の唯一の染色体正常 (欠) 胚の選択の利点を強調している 4 つのランダム化比較試験妊娠6,7,8,9を達成します。したがって、人間の異数性の病因を理解すること、生殖補助医療に重要な意味を持つことができます。
染色体異常で着床前遺伝子検査は不妊治療に有益であるが、染色体異常の発生の理解はまだ欠けています。減数分裂期の染色体異常 (配偶子生産の間に由来) と母親の年齢、しかし、いくつか女性存在異数性胚率の恵まれた時代4の平均レートを逸脱した正の相関関係があることを広く受け入れられています。これらのケースは、年齢だけが常に異数性胚を生成するリスクの予測ではないことをお勧めします。他の要因は遺伝子変異など胎児の異数性のリスクを増加させる役割を果たす可能性があります。
卵母細胞の減数分裂の間に異数性の遺伝子の変形の潜在的な貢献の調査の重要な側面は、減数分裂遺伝子機能を迅速に評価するシステムを設計することです。倫理的な制約と制限付きアクセスのため、卵子を使用してこれらのテストを実行する実用的ではありません。マウス卵母細胞を使用して、これらの問題を回避ことができます、ここで減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために試金のシリーズ私は説明しました。マウス卵人間蛋白質の局在化の可視化し、野生型および変異人間蛋白質の異所性発現結果いずれかのかどうかを判断するために使用によって興味の遺伝子の変形のためメッセンジャー RNA (mRNA) のコーディングを microinjecting、異数性につながることができる表現型の変化。これらの表現型は、動原体と重要な減数分裂 i 中期の染色体の整列をサポートすることができない妹に不適切に接続する微小管の増加、利得と機能の損失を調査するこのプロトコルを使用することができます。よう卵母細胞の減数分裂のキー イベントに挑戦する実験的条件を確立することによって遺伝的変異は、建物と染色体の整列10 をスピンドルします。
Protocol
1. 分子クローニング 興味の遺伝子のフルレングスのコード配列を取得およびプラスミッドの in vitro転写 (pIVT) ベクトル11。注: 完全長 cDNA クローンは、さまざまなベンダーから市販されているまたは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) を生成することができます。国立生物工学情報 (NCBI) オンライン リソース センターがヌクレオチドから遺伝子のトラン ス?…
Representative Results
培養後、A260/A280 率 (1.8 2.2) と分光光度計を使用して測定したとき A260/A230 比 ≥1.7 高品質 RNA があります。図1 図の試験管内での移行-変化の agarose のゲルの電気泳動後 RNA を生産します。パターンやサイズの複数のバンドを持つサンプルで塗られるバンドが汚染またはサンプルの劣化のことを示します。また、複数のバンドは、mRNA を…
Discussion
病気に関連付けられている人間の遺伝的変異の迅速かつ増加の識別のための生物学的意義を評価するシステムが確立されているが不可欠です。人間の卵子は貴重なまれな、人間の精子で遺伝子操作を受けやすいので人間減数分裂ポーズ特定課題におけるタンパク質の機能を理解します。マウス卵母細胞は減数分裂遺伝子機能10,23を評価する貴重な哺…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、アメリカ生殖医学会およびチャールズとラトガーズ大学でヨハンナ ブッシュ記念基金研究助成金によって支えられた、k. s. A.L.N. に NJ の州立大学は、N.I.H. (F31 HD0989597) からの助成金によって支えられました。
Materials
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
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Cite This Article
Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, Jr., R. T., Schindler, K. Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I. J. Vis. Exp. (134), e57442, doi:10.3791/57442 (2018).