Fastsettelse av Protease spesifisitet i musen vev ekstrakter av MALDI-TOF massespektrometri: manipulere PH å forårsake spesifisitet endringer
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å bestemme protease spesifisitet i råolje musen vev ekstrakter bruker MALDI-TOF massespektrometri.
Abstract
Proteaser har flere biologisk funksjoner, inkludert protein aktivering/deaktivering og mat fordøyelse. Identifisere protease spesifisitet er viktig for å avsløre protease-funksjonen. Metoden foreslått i denne studien bestemmer protease spesifisitet ved å måle molekylvekt av unike underlag bruker Matrix-assistert Laser desorpsjon/ionisering tid-av-fly (MALDI-TOF) massespektrometri. Substrater inneholder iminobiotin, mens cleaved området består av aminosyrer, og avstandsstykket består av polyetylenglykol. Cleaved substratet genererer en unik molekylvekt bruker en cleaved aminosyre. En av fordelene ved denne metoden er at den kan utføres i en pott med råolje prøver, og det er også egnet for å vurdere flere eksempler. I denne artikkelen beskriver vi en enkel eksperimentell metode optimalisert med eksempler Hentet fra musen lungevev, inkludert vev utvinning, plassering av fordøyelseskanal underlag i prøvene, rensing av fordøyelseskanal underlag under ulike pH-forhold , og måling av substrater molekylvekt bruker MALDI-TOF massespektrometri. I sammendraget gir denne teknikken identifikasjon av protease spesifisitet i råolje prøver fra vev ekstrakter bruker MALDI-TOF massespektrometri, som kan enkelt skaleres for flere eksempel behandling.
Introduction
Proteaser regulere fysiologiske prosesser ved cleaving proteiner, og oppstart av protease aktivitet på bestemte tider og steder er regulert1. Det er derfor viktig å identifisere uttrykk og aktivitet av vev som er lokalt regulert, og å utvikle en ny metode for å oppdage proteaser. Metoden foreslått i denne studien har som mål å identifisere protease spesifisitet parallelt å oppdage proteaser.
Det er noen metoder for å oppdage protease spesifisitet. Metoden azocasein er kjent for sin bruk i deteksjon av proteaser2 , men er begrenset i sin evne til å skaffe ytterligere informasjon. Zymography er en omfattende protease oppdagelse metode som kan brukes til å bestemme molekylvekt proteaser3, men den kan ikke brukes til å undersøke substrat spesifisitet. Protease spesifisitet kan bestemmes av spectrometric analyser, bruker underlag som p-nitroanilide4, og fluorometric analyser, bruker kumarin underlag5 eller fluorescens resonans energi overføring (bånd) analyser6. Disse metodene kan enkelt-spesifisitet påvisning av underlag i en enkelt brønn. Studien undersøkes protease spesifisitet av vev ekstrakter under ulike forhold, som disse utdragene inneholder flere proteaser. Protease aktivitet er regulert av flere faktorer, inkludert pH, koenzymer, prosthetic grupper og ion styrke. Nylig brukes Proteomikk-baserte metoder til å identifisere protease spesifisitet; for eksempel metoden rapportert av Biniossek et al. 7 bruker proteom til å bestemme substrat spesifisitet selv i råolje ekstrakter og lar nøyaktig bestemmelse av cleavage aktiviteten til proteaser gjenkjenner flere amino acid sekvenser8. Men er denne metoden ikke egnet for analyse av mange eksempler. Derimot vår metode kan samtidig behandling av flere eksempler, og bruk av Matrix-Assisted Laser desorpsjon/ionisering tid-av-fly (MALDI-TOF) massespektrometri for eksempel analyse muliggjør rask og enkel oppdagelsen av den kløyvde underlag.
Denne artikkelen beskriver en metode for å vurdere protease spesifisitet ved hjelp av MALDI-TOF massespektrometri måle molekylvekt av unike underlag. De molekylære formene av kløyvde underlag, sammen med deres teoretiske molekylvekt, er vist i figur 1 og tabell 1. Tidligere studier har brukt underlag som inneholder polyglycine spacere og biotin9; men er disse underlag feil fordi polyglycine serien kan være kløyvde av enzymer som gjenkjenner glysin sekvensen. I tillegg kan til høy affinitet mellom avidin og biotin føre til en lav utvinningsgrad. Til å forbedre disse ulempene, i denne studien vi syntetisert en unik underlaget, som besto av polyetylenglykol (PEG), iminobiotin og en aminosyre som kan identifisere webområdet cleavage (figur 1). For å skille mellom aminosyrer av lignende molekylvekt, ble D-serine lagt mellom PEG avstandsstykket og aminosyren på cleaved stedet.
N-terminal av underlaget ble merket med iminobiotin, som gjør affinitet rensing fra råolje prøver. Bruk av iminobiotin i stedet for biotin er avgjørende; biotin har en kraftig affinitet med avidin, som resulterer i lav utvinningsgraden av biotin-merket underlag fra avidin harpiks, mens iminobiotin’s affinitet for avidin kan endres ved pH. Iminobiotin-merket underlag vil binde til avidin forhold over pH 9, mens avidin utgivelser iminobiotin-merket underlag i forhold under pH 4. Iminobiotin ble derfor brukt affinitet rensing10. I sammendraget beskriver vi en detaljert protokoll for å oppdage protease spesifisitet bruker unike underlag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen bruker MALDI-TOF massespektrometri for å identifisere protease spesifisitet i råolje prøver fra vev ekstrakter og kan enkelt skaleres for flere eksempel behandling. Spesielt manipulert vi pH å forårsake en endring i underlaget spesifisitet.
Avidin-biotin komplekse (ABC) metoden, som har vært mye brukt i biokjemi på grunn av sin bindende spesifisitet, ble benyttet i våre protokollen. På grunn av sterk affinitet av ABC er binding av avidin til biotin nesten uhelbredeli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet var støttes delvis av den Nihon farmasøytiske University Research Grant fra Nihon farmasøytisk University (2016) og MEXT KAKENHI Grant nummer JP17854179.
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
