مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتحديد خصوصية حوزتي في النسيج الخام الماوس مقتطفات استخدام TOF استخدام قياس الطيف الكتلي.
Abstract
وقد البروتياز العديد من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك هضم البروتين التنشيط/المنظمة والغذاء. تحديد خصوصية حوزتي مهم للكشف عن حوزتي الدالة. الطريقة المقترحة في هذه الدراسة تحدد مبطلات خصوصية بقياس الوزن الجزيئي لركائز فريدة من نوعها باستخدام مصفوفة-بمساعدة الليزر الامتزاز/التأين وقت الطيران (استخدام-TOF) الطيف الكتلي. ركائز تحتوي على إيمينوبيوتين، بينما الموقع ملصوق يتكون من الأحماض الأمينية، ويتكون فاصل من البولي إيثيلين غليكول. سوف تولد الركيزة ملصوق وزن الجزيئي فريدة من نوعها باستخدام الأحماض الأمينية ملصوق. ومن مزايا هذا الأسلوب هو أنه قد تجري في وعاء واحد باستخدام عينات النفط الخام، وأيضا مناسبة لتقييم عينات متعددة. في هذا المقال، يمكننا وصف أسلوب تجريبي بسيط الأمثل مع العينات المستخرجة من أنسجة الرئة الماوس، بما في ذلك استخراج الأنسجة، وضع ركائز الجهاز الهضمي في عينات، وتنقية ركائز الجهاز الهضمي تحت ظروف مختلفة الأس الهيدروجيني ، وقياس الوزن الجزيئي لركائز استخدام TOF استخدام الطيف الكتلي. باختصار، تسمح هذه التقنية للتعرف على خصوصية حوزتي في عينات النفط الخام المستمدة من مقتطفات الأنسجة استخدام TOF استخدام الطيف الكتلي، التي يمكن بسهولة الارتقاء لتجهيز نماذج متعددة.
Introduction
البروتياز تنظيم العمليات الفيزيولوجية التي ناهضة البروتينات، وبدء نشاط البروتياز في أوقات محددة ومواقع التنظيم1. ولذلك من المهم تحديد التعبير والنشاط للأنسجة التي يتم تنظيمها محلياً، ووضع طريقة جديدة للكشف عن البروتياز. الطريقة المقترحة في هذه الدراسة تهدف إلى التعرف على خصوصية حوزتي بالتوازي مع كشف البروتياز.
توجد بعض الطرق للكشف عن خصوصية حوزتي. الأسلوب أزوكاسين معروفة لاستخدامها في الكشف عن البروتياز2 ولكن محدودة في قدرتها على الحصول على مزيد من المعلومات. زيموجرافي هو آخر طريقة الكشف عن حوزتي الشاملة التي يمكن استخدامها لتحديد الوزن الجزيئي من البروتياز3، ولكن لا يمكن استخدامه لدراسة خصوصية الركازة. يمكن تحديد خصوصية حوزتي فحوصات والمطيافيه، استخدام ركائز مثل نيتروانيليدي ف-4، وفحوصات فلوروميتريك، استخدام الكومارين ركائز5 أو فحوصات Fluorescence الرنين الطاقة نقل (بكى)6. هذه الأساليب تمكين الكشف عن خصوصية واحدة من ركائز الوارد في بئر واحدة. في هذه الدراسة، هو دراسة خصوصية حوزتي مقتطفات الأنسجة تحت ظروف مختلفة، كما تحتوي هذه المقتطفات البروتياز متعددة. وينظم العديد من العوامل، بما في ذلك درجة الحموضة والأنزيمات المساعدة ومجموعات الاصطناعية وقوة أيون نشاط البروتياز. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت الأساليب المستندة البروتيوميات تحديد خصوصية حوزتي؛ على سبيل المثال، الطريقة التي أفادت بها بينيوسيك وآخرون. 7 يستخدم البروتين لتحديد خصوصية الركيزة حتى في مقتطفات النفط الخام ويسمح تحديد دقيق لنشاط البروتياز التي تعترف بتسلسل الأحماض الأمينية متعددة8الانقسام. ومع ذلك، هذا الأسلوب غير مناسب لتحليل العينات العديدة. وفي المقابل، تمكن لدينا أسلوب المعالجة المتزامنة لعينات متعددة، واستخدام ماتريكساسيستيد الليزر الامتزاز/التأين وقت الطيران (استخدام-TOF) الكتلي لتحليل العينات ويسهل الكشف السريع والسهل ملصوق ركائز.
وتلخص هذه الورقة أسلوباً لتقييم خصوصية حوزتي باستخدام TOF استخدام الطيف الكتلي لقياس الوزن الجزيئي لركائز فريدة من نوعها. النماذج الجزيئية لركائز ملصوق، جنبا إلى جنب مع أوزانها الجزيئية النظرية، مبينة في الشكل 1 و الجدول 1. الدراسات السابقة استخدمت الركازات المحتوية على الفواصل بوليجليسيني والبيوتين9؛ ومع ذلك، هي معيبة هذه ركائز لأنه قد يكون المشقوق التسلسل بوليجليسيني بالأنزيمات التي تعترف بالتسلسل جليكاين. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي تقارب عالية بين عبدين والبيوتين إلى معدل استرداد منخفضة. ولتحسين هذه العيوب، في هذه الدراسة أننا توليفها الركازة فريد، الذي كان يتألف من البولي إيثيلين غليكول (شماعة)، إيمينوبيوتين، وهو من الأحماض الأمينية التي يمكن تحديد موقع الانقسام (الشكل 1). وأضيف إلى تميز بين الأحماض الأمينية من الأوزان الجزيئية مماثلة، د-سيرين بين مباعدة شماعة والأحماض الأمينية في الموقع ملصوق.
N–المحطة طرفية الركازة وصفت مع إيمينوبيوتين، الذي يتيح لتنقية تقارب من عينات النفط الخام. يتم استخدام إيمينوبيوتين بدلاً من البيوتين الحرجة؛ البيوتين له صلة قوية مع عبدين، الذي ينتج معدلات الاسترداد منخفضة من ركائز المسمى البيوتين من الراتنج عبدين، بينما يمكن تغيير النسب في إيمينوبيوتين لعبدين بالاس الهيدروجيني. سيتم ربط ركائز المسمى إيمينوبيوتين avidin في الشروط أعلاه الرقم الهيدروجيني 9، بينما avidin النشرات ركائز المسمى إيمينوبيوتين في ظروف أقل درجة الحموضة 4. ولذلك، استخدم إيمينوبيوتين ل تنقية تقارب10. وباختصار، يصف لنا بروتوكول مفصلة للكشف عن خصوصية حوزتي استخدام ركائز فريدة من نوعها.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يستخدم TOF استخدام الطيف الكتلي للتعرف على خصوصية حوزتي في عينات النفط الخام المستمدة من مستخلصات الأنسجة ويمكن الارتقاء بسهولة لتجهيز نماذج متعددة. على وجه الخصوص، نحن التلاعب بدرجة الحموضة تسبب تغييرا في خصوصية الركازة.
واستخدمت الطريقة (ABC) عبدين-البيوتين …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل جزئيا “منحة بحثية جامعة نيهون الصيدلانية” من جامعة نيهون الصيدلانية (2016) و JP17854179 رقم المنحة كاكينهي يأمرون.
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
