CARIP-Seq en ChIP-Seq: methoden voor het identificeren van de chromatine-geassocieerde RNAs en eiwit-DNA interacties in embryonale stamcellen
Summary
Hier beschrijven we methoden voor het uitvoeren van ChIP-Seq en CARIP-Seq, met inbegrip van de voorbereiding van de bibliotheek van next-generation sequencing, voor het genereren van wereldwijde epigenomic en chromatine-geassocieerde RNA kaarten in ES-cellen.
Abstract
Embryonale stamcellen (ES) cel zelf-vernieuwing en differentiatie wordt beheerst door Extrinsieke signalen en intrinsieke netwerken van transcriptiefactoren, epigenetische regelgevers en na vertaling wijzigingen van histonen dat combinatorisch het gen beïnvloeden staat van de expressie van genen die in de buurt. RNA is ook aangetoond dat interactie met verschillende eiwitten chromatine dynamiek en expressie van genen te reguleren. Chromatine-geassocieerde RNA immunoprecipitation (CARIP) gevolgd door sequentiebepaling van volgende-generatie (CARIP-Seq) is een nieuwe methode om RNAs gekoppeld chromatine eiwitten, terwijl de chromatine immunoprecipitation, gevolgd door sequentiebepaling van volgende-generatie (enquête ChIP-Seq) is een krachtige genomics techniek om de kaart van de locatie van de posttranslationele wijziging van histones, transcriptiefactoren en epigenetische modifiers op een wereldwijde schaal-in ES-cellen. Hier beschrijven we methoden voor het uitvoeren van CARIP-Seq en ChIP-Seq, met inbegrip van bibliotheek constructie voor de volgende generatie sequencing, voor het genereren van globale chromatine-geassocieerde RNA en epigenomic kaarten in ES-cellen.
Introduction
Embryonale stamcellen (ES) cel lot besluiten worden gereguleerd door de communicatie tussen de extracellulaire signalen en een heleboel transcriptionele-regelgevers, met inbegrip van Histon modifiers, en na vertaling wijziging van Histon staarten. Deze interacties vergemakkelijken chromatine toegankelijkheid en verpakking van de chromatine in één van twee staten: euchromatine, die is geopend en transcriptionally actief, en heterochromatin, die is compact en over het algemeen transcriptionally inactieve. Transcriptiefactoren met DNA sequentie-specifieke bindende affiniteiten en epigenetische modifiers vennoot met euchromatique regio’s te nemen bij het beheersen van de genexpressie. Volgende-generatie sequencing methoden, met inbegrip van ChIP-Seq1, zijn instrumentale in kaart brengen van genoom-brede transcriptionele netwerken die fundamenteel zijn voor ES cel zelf-vernieuwing en pluripotent2,3,4 ,5,6. Bovendien, terwijl RNA immunopreciation gevolgd door de volgende-generatie sequencing (RIP-Seq)7 evaluaties van RNA-eiwit interacties suggereren dat DNA-bindende proteïnen interactie met RNAs te reguleren transcriptionele gebeurtenissen7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, weinig studies hebben onderzocht de genoom-brede lokalisatie van RNAs chromatine12of globale interactie tussen RNA en histone modificaties is gekoppeld. Lang niet-coderende RNAs (lncRNAs) vormen een klasse van RNAs die zijn gevonden voor het regelen van de activiteit van chromatine-geassocieerde eiwitten13,14,15. Bijvoorbeeld, is Xist een lncRNA die wordt geregeld, in vrouwelijke zoogdiercellen inactivatie van één X-chromosoom, door de aanwerving van epigenetische repressors16,17. Het volledige spectrum van RNAs gekoppeld chromatine is echter grotendeels onbekend. Hier beschrijven we een nieuw protocol, chromatine-geassocieerde RNA immunoprecipitation (CARIP) gevolgd door sequentiebepaling van de volgende generatie (CARIP-Seq), te identificeren van chromatine-geassocieerde RNAs op basis van genoom-brede in ES-cellen, met inbegrip van bibliotheek voorbereiding voor volgende-generatie sequencing en ChIP-Seq global bezetting van Histon modificaties, transcriptiefactoren en epigenetische parameters toewijzen. In tegenstelling tot andere RIP-Seq methoden7bevat CARIP-Seq crosslinking en ultrasoonapparaat stappen, waarmee voor de directe identificatie van de RNAs chromatine is gekoppeld. Samen ChIP-Seq is een krachtig hulpmiddel om te identificeren van genoom-brede eiwit-DNA interacties, terwijl CARIP-Seq is een krachtige methode om enquête RNAs chromatine onderdelen zijn gekoppeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
ChIP-Seq is een handige methode om te evalueren van de locatie van globale eiwit-DNA interacties (bv., transcriptie factoren/Histon wijzigen enzymen/histone modificaties en DNA) in ES-cellen, terwijl de nieuw ontwikkelde CARIP-Seq-protocol is nuttig in genoom-brede vereniging van RNAs met chromatine kiezers te ondervragen. ChIP-Seq is een fundamenteel instrument dat wordt gebruikt ter beoordeling van de epigenetische landschappen van ES-cellen en andere celtypes. De kwaliteit van ChIP-Seq en CARIP-Seq bibliothek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, een subsidie van de National Heart-, Long- en bloed Instituut (1K22HL126842-01A1) toegekend aan B.L.K. Dit werk gebruikt de Wayne State Universiteit hoge Performance Computing Grid voor computationele middelen (). Wij danken Jiji Kurup voor hulp bij CARIP-Seq data-analyse.
AUTEURS DE BIJDRAGEN:
B.L.K. van de CARIP-Seq-methode bedacht, ontworpen en de ChIP-Seq en CARIP-Seq experimenten uitgevoerd analyseerde de gegevens rangschikken en opgesteld van het manuscript. Alle auteurs hebben gelezen en goedgekeurd van de definitieve versie van dit manuscript.
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center’s improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
