CARIP-FF. og ChIP-Seq: metoder til at identificere kromatin-associerede RNA'er og Protein-DNA interaktioner i embryonale stamceller
Summary
Her, vi beskriver metoder til at udføre ChIP-FF. og CARIP-FF., herunder bibliotek forberedelse til næste generation sequencing, til at skabe global epigenomiske og kromatin-associerede RNA kort i ES-celler.
Abstract
Embryonale stamceller (ES) celle selvfornyelse og differentiering er underlagt udefrakommende signaler og iboende netværk af transkriptionsfaktorer, epigenetiske regulatorer og efter oversættelse ændringer af histoner, combinatorially indflydelse på genet udtrykket tilstand af nærliggende gener. RNA har også vist sig at interagere med forskellige proteiner til at regulere kromatin dynamics og genekspression. Kromatin-associerede RNA immunoprecipitation (CARIP) efterfulgt af næste generation sequencing (CARIP-FF.) er en roman metode til undersøgelse RNA’er tilknyttet kromatin proteiner, mens kromatin immunoprecipitation efterfulgt af næste generation sequencing ( ChIP-Seq) er en kraftfuld genomforskning teknik til at kortlægge placeringen af posttranslationel modifikation af histoner, transkriptionsfaktorer og epigenetiske modifikatorer på et globalt i ES-celler. Her, beskriver vi metoder til at udføre CARIP-FF. og ChIP-FF., herunder bibliotek opbygning til næste generation sequencing, for at skabe globale kromatin-associerede RNA og epigenomiske kort i ES-celler.
Introduction
Embryonale stamceller (ES) celle skæbne beslutninger er reguleret af kommunikation mellem ekstracellulære signaler og et væld af transcriptional-regulatorer, herunder Histon modifikatorer, og efter oversættelse ændring af Histon haler. Disse interaktioner lette kromatin tilgængelighed og emballering af kromatin i en af to tilstande: euchromatin, som er åben og transcriptionally aktive, og heterochromatin, som er kompakt og generelt transcriptionally inaktive. Transkriptionsfaktorer med DNA sekvens-specifikke bindende tilhørsforhold og epigenetiske modifikatorer associeret med euchromatic regioner til at deltage i kontrol af genekspression. Næste generations sekventering metoder, herunder ChIP-Seq1, har været medvirkende til kortlægning genome-wide transcriptional netværk, der er grundlæggende for ES celle selvfornyelse og pluripotency2,3,4 ,5,6. Desuden, mens RNA immunopreciation efterfulgt af næste generation sequencing (RIP-Seq)7 evalueringer af RNA-protein interaktioner tyder på, at DNA-bindende proteiner interagere med RNA’er at regulere transcriptional begivenheder7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, få studier har undersøgt genome-wide lokalisering af RNA’er tilknyttet kromatin12eller globale interaktioner mellem RNA og Histon ændringer. Længe ikke-kodende RNA’er (lncRNAs) er en klasse af RNA’er, som er blevet fundet for at regulerer aktiviteten af kromatin-associerede proteiner13,14,15. For eksempel, er Xist en lncRNA, der regulerer, i kvindelige pattedyrceller, inaktivering af et X-kromosom, gennem ansættelse af epigenetiske repressors16,17. Men det fulde spektrum af RNA’er tilknyttet kromatin er stort set ukendt. Her, beskriver vi en roman protokol, kromatin-associerede RNA immunoprecipitation (CARIP) efterfulgt af næste generation sequencing (CARIP-FF.), at identificere kromatin-associerede RNA’er på basis genome-wide i ES-celler, herunder bibliotek forberedelse til næste generation sequencing, og ChIP-Seq at kortlægge globale belægning af Histon ændringer, transkriptionsfaktorer og epigenetiske modifikatorer. I modsætning til andre RIP-Seq metoder7omfatter CARIP-Seq crosslinking og ultralydbehandling trin, som giver mulighed for direkte identifikation af RNA’er tilknyttet kromatin. Sammen, ChIP-Seq er et kraftfuldt værktøj til at identificere genome-wide protein-DNA interaktion, mens CARIP-Seq er en kraftfuld metode til at kortlægge RNA’er tilknyttet kromatin komponenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
ChIP-Seq er en nyttig metode til at vurdere placeringen af globale protein-DNA interaktioner (fx., transskription faktorer/Histon ændre enzymer/Histon ændringer og DNA) i ES-celler, mens den nyudviklede CARIP-Seq protokol er nyttige i afhører genome-wide association af RNA’er med kromatin bestanddele. ChIP-Seq er et grundlæggende redskab, der bruges til at evaluere epigenetiske landskaber af ES-celler og andre celletyper. Kvaliteten af ChIP-FF. og CARIP FF. biblioteker er i vid udstrækning afhængig af ChIP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, et tilskud fra National Heart, Lung og Blood Institute (1K22HL126842-01A1) tildeles B.L.K. Dette arbejde udnyttes Wayne State University høj Performance Computing gitteret for it-ressourcer (). Vi takker Jiji Kurup for bistand med CARIP-Seq dataanalyse.
FORFATTERNES BIDRAG:
B.L.K. udtænkt af metoden CARIP-FF., designet og udført ChIP-FF. og CARIP FF. eksperimenter, analyseret sequencing data og udarbejdet manuskriptet. Alle forfattere har læst og godkendt den endelige version af dette manuskript.
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center’s improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
