Summary

CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen

Published: May 25, 2018
doi:

Summary

Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von ChIP-Seq und CARIP-FF, einschließlich der Bibliothek Vorbereitung auf Next Generation Sequencing, global epigenomischen und Chromatin-assoziierter RNA zu generieren-Karten von ES-Zellen.

Abstract

Embryonale Stammzellen (ES) Zelle Selbsterneuerung und Differenzierung unterliegt extrinsische Signale und intrinsische Netzwerke von Transkriptionsfaktoren, epigenetische Regulatoren und Post-Übersetzung Modifikationen der Histone, die das Gen kombinatorisch beeinflussen Ausdruck Zustand des nahe gelegenen Gene. RNA hat sich auch gezeigt, zur Interaktion mit verschiedenen Proteinen, Chromatin Dynamik und Genexpression regulieren. Chromatin-assoziierter RNA Immunopräzipitation (CARIP) gefolgt von Next Generation Sequencing (CARIP-Seq) ist eine neuartige Methode zur RNA zugeordnete Chromatin Proteine, während Chromatin Immunopräzipitation gefolgt von Next Generation Sequencing (Umfrage ChIP-Seq) ist eine leistungsstarke Genomik-Technik, um den Lageplan des Post-translationale Modifikation der Histone, Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikatoren auf einer globalen Skala in ES-Zellen. Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von CARIP-Seq und ChIP-Seq, einschließlich Bibliotheksbau für Next-Generation Sequenzierung, um globale Chromatin-assoziierter RNA und epigenomischen Karten in Embryonaler Stammzellen zu erzeugen.

Introduction

Kommunikation zwischen extrazelluläre Signale und eine Reihe von transkriptionelle-Aufsichtsbehörden, einschließlich der Histon-Modifikatoren und Post-Übersetzung Änderung der Histone Tails sind embryonale Stammzellen (ES) Zelle Schicksal Entscheidungen geregelt. Diese Interaktionen Erleichterung Chromatin Zugänglichkeit und Verpacken von Chromatin in einen von zwei Zuständen: Euchromatin, das offen und transcriptionally aktiv ist, und Heterochromatin, das kompakt und in der Regel transcriptionally inaktiv ist. Transkriptionsfaktoren mit DNA-Sequenz-spezifische verbindliche Affinitäten und epigenetische Modifikatoren Associate bei euchromatisch Regionen zur Teilnahme bei der Kontrolle der Genexpression. Next Generation Sequencing-Methoden, einschließlich der ChIP-Seq1, haben bei der Kartierung genomweite transcriptional Netze, die grundlegend für ES Zelle Selbsterneuerung und Pluripotenz2,3,4 sind maßgeblich ,5,6. Darüber hinaus während der RNA Immunopreciation gefolgt von der nächsten Generation Sequenzierung (RIP-Seq)7 Bewertungen von RNA-Protein-Wechselwirkungen legen nahe, dass DNA-bindende Proteine RNAs interagieren regulieren transkriptionelle Ereignisse7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, haben nur wenige Studien untersucht die genomweite Lokalisierung von RNAs Chromatin12oder globale Wechselwirkungen zwischen RNA und Histon Änderungen zugeordnet. Lange nicht-kodierende RNAs (LncRNAs) sind eine Klasse von RNAs, die gefunden wurden, um die Tätigkeit von Chromatin-assoziierte Proteine13,14,15Regeln. Xist ist beispielsweise eine LncRNA, die im weiblichen Säugerzellen, Inaktivierung eines x-Chromosoms durch die Rekrutierung von epigenetischen Repressoren16,17regelt. Das gesamte Spektrum der RNAs zugeordnete Chromatin ist jedoch weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll, Chromatin-assoziierter RNA Immunopräzipitation (CARIP) gefolgt von Next Generation Sequencing (CARIP-Seq), Chromatin-assoziierten RNAs auf einer genomweiten Basis in ES-Zellen, einschließlich Bibliothek Vorbereitung zu identifizieren für Next Generation Sequencing und ChIP-Seq globale Belegung von Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikatoren zuordnen. Im Gegensatz zu anderen RIP-Seq Methoden7enthält CARIP-Seq Vernetzung und Beschallung Schritte, die für die direkte Identifizierung von RNAs Chromatin zugeordnet zu ermöglichen. Gemeinsam ChIP-Seq ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur genomweiten Protein-DNA-Wechselwirkungen zu identifizieren, während CARIP-Seq ist eine leistungsfähige Methode zur Übersicht RNAs mit Chromatin Komponenten verbunden.

Protocol

(1) Kultur der Maus ES Zellen im Feeder-freien Bedingungen. Hinweis: Maus-ES-Zellen sind konventionell in Medien auf eine Zelle Kulturschale mit Gelatine und eine Mono-Schicht der Maus embryonalen Fibroblasten (MEF), die mitotically inaktiviert wurden beschichtet (iMEFs) kultiviert. Jedoch sollten MEFs vor dem nachgeschalteten epigenetische oder Ausdruck Analysen der Verunreinigung des MEF-assoziierten Chromatin und RNA entfernt werden. Vorbereitung eines Feeder-Layers: Gelatine Mant…

Representative Results

Wir verhört erfolgreich die genomweite Bindung von H3K4me3, H3K4me2 und KDM5B in ES-Zellen mit diesem ChIP-Seq-Protokoll-6. ES-Zellen wurden im Feeder-freien Bedingungen (Abbildung 1) und vernetzt wie oben beschrieben. Beschallung wurde anschließend wie in Schritt 3.2 des ChIP-Seq-Protokolls beschrieben durchgeführt und bewertet durch Ausführen von DNA auf einem 2 % Agarosegel (Abbildung 2). Als nächs…

Discussion

ChIP-Seq ist eine nützliche Methode, die Lage des globalen Protein-DNA-Wechselwirkungen zu bewerten (zB., Transkription Faktoren/Histon-modifizierende Enzyme/Histon Änderungen und DNA) in ES-Zellen, während der neu entwickelte CARIP-Seq-Protokoll nützlich ist abfragenden genomweite RNAs mit Chromatin Bestandteile. ChIP-Seq ist ein grundlegendes Instrument, das verwendet wird, um epigenetische Landschaften von ES-Zellen und andere Zelltypen zu bewerten. Die Qualität der ChIP-Seq und CARIP-Seq-Bibliotheken is…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, ein Stipendium des National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) an B.L.K. vergeben unterstützt. Diese Arbeit genutzt, die Wayne State Universität High Performance Computing Grid für computational Ressourcen (). Wir danken für die Unterstützung bei CARIP-Seq Datenanalyse Jiji Kurup.

AUTOREN-BEITRÄGE:

B.L.K. der CARIP-Seq-Methode konzipiert, entworfen und ChIP-Seq und CARIP-Seq Experimente durchgeführt die Sequenzierungsdaten analysiert und erarbeitet das Manuskript. Alle Autoren haben gelesen und genehmigt die Endfassung des Manuskripts.

Materials

Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) EMD Millipore 106 or 107 units
GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) Stemgent Solvent: DMSO 10mM
MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) Stemgent Solvent: DMSO 10mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose Invitrogen 11965092
PBS (phosphate buffered saline) Invitrogen 10010031
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
2-Mercaptoethanol (50 mM) Gibco 31350010
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140076
EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml EMD Millipore ES-009-B
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution EMD Millipore ES-006-B
Glycine Sigma G7126-500G 1.25 M stock conentration in water
Formaldehyde solution Sigma F8775-500ML
TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X Quality Biological 351-011-131
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution Sigma 93482-250ML-F
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001
Sodium dodecyl sulfate solution (20%) Quality Biological A611-0837-10
Q125 sonifier Qsonica 4422
Triton X-100 solution Sigma 93443-100ML
Sodium deoxycholate Sigma 30970
NaCl Sigma S7653
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Invitrogen 10004D
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack Invitrogen 10015D
Lithium chloride Sigma L4408
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) Invitrogen 61006
SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11917010
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER81050
Klenow Fragment (3'→5' exo-) NEB M0212L
dATP (10 mM) Invitrogen 18252015
T4 DNA ligase NEB M0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder Invitrogen 10488085
E-gel EX agarose gels, 2% Invitrogen G402002
Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer Thermo Fisher F531LPM
ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody EMD Millipore 17-614
Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) Abcam ab32356
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) Fisher 720083
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) Fisher 08772E
Bioruptor pico Diagenode B01010001
Qubit Flurometer 2.0 Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
MinElute Reaction Cleanup Kit Qiagen 28204
MinElute Gel Extraction Kit Qiagen 28604
Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) Abcam ab9053
Labquake rotator Thermo Fisher 400110Q
Illumina HiSeq platform Illumina
TURBO DNase Invitrogen AM2238

References

  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
  3. Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
  4. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
  5. Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
  6. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
  7. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  10. Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
  11. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
  12. Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
  13. Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
  14. Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
  15. Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
  16. Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  17. Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
  18. Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
  19. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
  20. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  21. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  22. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  23. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  24. Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
  25. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
  26. Quail, M. A., et al. A large genome center’s improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
  27. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).

Play Video

Cite This Article
Kidder, B. L. CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (135), e57481, doi:10.3791/57481 (2018).

View Video