Bu iletişim kuralı virüs teslim edilmek üzere fare prostat yeni kurulan bir yöntem açıklanır. CRISPR/Cas9 teknolojisi, gen overexpression veya Cre recombinase teslim kullanarak, teknik gen ifadesinin orthotopic değişiklik sağlar ve prostat kanseri için bir roman fare modeli uygular.
Artan bir prostat kanseri insidansı ile yeni tümör sürücüleri veya modülatörler kimliği çok önemlidir. Prostat kanseri için genetik fare modelleri (et) tümör heterojenite ve onun karmaşık microevolution dynamics tarafından engel vardır. Geleneksel prostat kanseri fare modelleri içerir, diğerleri arasında germline ve koşullu altını gizleme, oncogenes ve xenograft modelleri transgenik ifadesi. Bu modeller de novo mutasyonların, zaman alıcı, karmaşık ve pahalı olduğunu. Ayrıca, insan prostat kanseri hücreleri yalnızca küçük bir bölümünün içinde izole bir olay olarak gelişmeye bilinen ise geleneksel modellerin çoğu prostat epiteli, çoğunluğu hedef. Prostat kanseri başlatma, hem de gelişmiş hastalık ilerleme benzetimini yapmak değerli modelleri gerekir.
Burada bir kaç prostat epitel hücrelerinde transducing hücreleri tarafından tarafından viral parçacıkların hedeflemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Fare prostat için tasarlanmış bir virüs teslim prostat epiteli gen ekspresyonu değiştirilmesini sağlar. Bu vesile ile virüs türü ve miktarı gen değişikliğini için hedeflenen hücreleri kanser başlatılması için birkaç hücre ve gen tedavisi için birçok hücre transducing tarafından tanımlayacaktır. Cerrahi tabanlı enjeksiyonuyla ön LOB, idrar izlemek, distal tümör bu modelde hayvan idrar işlev bozulması olmadan genişletebilirsiniz. Ayrıca, yalnızca alt küme küme küme prostat epitel hücrelerinin hedefleyerek teknik tümör klonal genişleme sağlar ve bu nedenle insan tümör başlatma, ilerleme gibi işgal Bazal membran aracılığıyla taklit eder.
Bu roman tekniği geliştirilmiş fizyolojik alaka ile güçlü prostat kanseri modeli sağlar. Hayvan acı sınırlıdır ve hiçbir ek ıslahı gerekli olduğundan, genel olarak hayvan sayısı azalır. Aynı zamanda, yeni aday genler ve yolları analizi, hızlandırılmış hangi sırayla daha fazla etkili maliyetidir.
Algılama ve prostat kanseri tedavisinde son on yıl içinde önemli ölçüde iyileştirilmiştir. Hala, prostat kanseri insidansı, yaşam beklentisi artıyor. Bir tahmini 1.1 milyon yeni vaka ile dünya çapında, kanserle ilgili ölüm erkekler 1‘ deki en yaygın nedenleri arasındadır. Prostat kanseri gelişimi içinde yavaş, ama ne zaman kanser için gelişmiş bir metastatik devlet ilerlemiştir, sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle prognozu kötüdür. Şimdiye kadar sadece birkaç genler bu kanserde ortak sürücüleri olarak tespit edilmiştir ve onun heterojenite ve multifocality engellemektedir, biyolojik ve targetable hastalığı sürücüleri2,3.
Klasik teknikleri üreten GEMMs kez onların karmaşıklığı, zamanında giderleri ve masrafları tarafından Engelli. Koşullu nakavt modelleri ne zaman germline4‘ te inaktive embriyonik ölümcül neden prostat kanseri aday genler, eğitim için yaygın olarak kullanılmaktadır. En yaygın modelleri tarafından değiştirilmiş Probasin5 tahrik Prostat spesifik Cre recombinase veya ek çarpı işareti-doğurmak tarafından et entegre bir PSA6 organizatörü içerir. Bu modellerinde gen ilgi Hiperplazi hayvanın idrar yolu işlev7bozabilen tüm organ içinde üreten çoğu prostat epitel hücrelerinin hedeflenecektir.
Fare prostat ön LOB içine enjeksiyonla Cre proteinin viral teslim sadece birkaç hücre8hedefleyerek bu sorunu çözebilirsiniz. Laboratuvarları teknik önkoşulları, uzmanlık ve hedefler yöntem yarar–dan çok çeşitli olası değişimler dikkate alarak. Başarılı yaklaşımlar Adenovirus JunB ve Pten9 veya Lentivirus Pten ve Trp5310 Hedefleme hedefleme kullanan diğerleri arasında göstermiştir. Transgenes, luciferase gibi viral yapı veya et ekleme Ayrıca11Imaging bioluminescence yoluyla hastalık progresyon non-invaziv izleme olanak sağlar.
Genom CRISPR/Cas9 teknolojisini temel alan düzenleme yeni ve hızlı bir fırsat kanser hızlı somatik knockouts12nesil aracılığıyla çalışma ortaya koymaktadır. İçin fare prostat LOB anterior yönettiği tek Kılavuzu RNA’ların (sgRNAs) viral teslimini prostat kanseri fizyolojik olarak daha alakalı bir model oluşturur. Bu şekilde, seçilen mutasyonlar taşıyan tek hücreleri istila ve genişleme verebilir klonlar oluşabilir. Ayrıca, birden çok hedef genlerin için Kılavuzu RNA’ların kullanımını farklı genler Hücre klonlar değişiklikler ile oluşturur. Bu tümör heterojenite ve doğal seleksiyon basınç her gen değişikliğini veya epistatic mekanizmalar önemini ortaya çıkarabilir kanser ilerlemesine izin verir.
Burada fare prostat gen ekspresyonu İLETİMLERİNİZE için viral parçacıkların sunmak için bir yöntem mevcut. Karın küçük bir kesi, fare ön prostat LOB maruz ve viral parçacıkların LOB enjekte edilir. Beş gün sonrası cerrahi, cerrahi klipleri deriden kaldırılabilir ve prostat kanseri 8 hafta sonra analiz edilebilir. Genel olarak, bu küçük etkisi: fare ve fare ödün vermeden geliştirmek daha büyük tümör sağlayan bir hızlı ve maliyet-etkin yordamdır.
Bu protokol için biz ön lobunda gen ekspresyonu fare prostat virüs enjeksiyonu ile değiştirmek için bir yöntem prostat kanseri (Şekil 2) bir güçlü yeni fare modeli oluşturma açıklanmaktadır. Bir Adenovirus başarılı yönetim ilk Leow ve ark. 20058tarafından tanımlanmıştır. Biz daha önce nasıl bir Adenovirus için Cre recombinase protein kodlama zaman alıcı çarpı işareti-doğurmak için doku özgü silme 9 (…
The authors have nothing to disclose.
Bay Danimarka Kanser Derneği (R146-A9394-16-S2) bir bursu tarafından finanse edildi. MFB ve MKT AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8) tarafından finanse edilmiştir. Bay ve MFB co finanse edilmiştir Graduate School, sağlık, AU. E.F.W. laboratuvar İspanyolca Bakanlığı Ekonomi (SAF2015-70857, eş ERDF-AB tarafından finanse edilen) ve grant (741888 – olay yeri inceleme-eğlenceli) gelişmiş bir ERC gelen hibe tarafından desteklenmektedir.
Liliana Fajardo Mellor (genler, geliştirme ve hastalık; teşekkür etmek istiyorum Ulusal Kanser Araştırma Merkezi) için eleştirel okuma şekilde alt alta yazılmalıdır.
Equipment | |||
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
Heating pad | multiple suppliers | ||
Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
Microscope | Leica | different models have been used | |
Reagents | |||
1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
Antisedan | obtained from the animal facility | ||
Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
Midazolam | obtained from the animal facility | ||
100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
Eye ointment | Takeda | 7242 | |
Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |