التصور الملاحة إكسون موتور والتحديد الكمي أربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس استخدام الورقة الضوء الفلورية مجهرية
Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتصور الإسقاط الحركية وأربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس Hb9::GFP المعدلة وراثيا. بعد إيمونوستينينج للخلايا العصبية الحركية، استخدمنا الورقة الضوء الفلورية مجهرية للأجنة صورة للتحليل الكمي اللاحقة. ينطبق هذا البروتوكول على الأخرى عمليات الملاحة العصبية في الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
توسيع العمود الفقري من الخلايا العصبية الحركية (MNs) على محاور عصبية التواصل مع أهدافها إينيرفاتينج، وبالتالي السيطرة على الحركة والمهام المعقدة في الفقاريات. وبالتالي، من المهم للكشف عن الآليات الجزيئية لكيف تستهدف السيارات انتقل إلى محاور عصبية وأربوريزي ويعصب العضلات المحيطة بهم خلال التنمية، وانحطاط. على الرغم من أن خطوط الماوس Hb9::GFP المعدلة وراثيا منذ فترة طويلة أدت إلى تصور مسارات إكسون السيارات أثناء التطور الجنيني، وصفاً تفصيليا من الطيف الكامل من أربوريزاتيون الطرفية إكسون تظل ناقصة بسبب تعقد نمط و القيود المفروضة على المجهر الضوئي الحالي. هنا، يمكننا وصف بروتوكولا محسنة التي تجمع بين الورقة الضوء الفلورية مجهرية () وتحليل صورة قوية كما وكيفا تصور وضع محاور عصبية المحرك. ويمكن اعتماد هذا النظام بسهولة عبر طفرات وراثية أو نماذج المرض مينيسوتا مع خطوط Hb9::GFP ، الكشف عن الآليات الجزيئية الرواية التي تؤدي إلى عيوب في موتور إكسون الملاحة وأربوريزيشن.
Introduction
MNs العمود الفقري هي الجزء من الجهاز العصبي المركزي ولكن يعصب العضلات الطرفية للتحكم في الحركة. في الحبل الشوكي النامي، تقام المتكفل مينيسوتا (بمنس) وفقا للإشارات المنبثقة عن notochord وسميتس المتاخمة. كل ما يميز MNs الانقسامية بعد ثم يتم إنشاؤها من بمنس، مما أدى في نهاية المطاف إلى سلسلة من المخططات MN على طول محور روستروكودال في الحبل الشوكي1،2. MNs العمود الفقري منظمون طبوغرافيا وتشريحيا جيدا. ترتيب الخصائص المورفولوجية يرتبط بوضع هدف كل منهما في هامش3. عند الوصول إلى أهدافهم العضلات، تلقي محاور عصبية نيوروتروفيك الخلوية والخارجية من العوامل التي حملها على تمديد وفرع آخر في العضلات. تعصيب وعيوب التفريع قد تسهم في عدم تشكيل الوصلات العصبية العضلية (NMJ). على سبيل المثال، عوامل نيوروتروفيك المستمدة من الدبقية (جدنف)-Pea3 المتعمد لا غنى عنه لمحور عصبي أربوريزيشن إلى مكسيموس الجلدية (سم) والعضلات latissimus dorsi (LD)4،5. وبالإضافة إلى ذلك، تظهر الأجنة الماوس بالضربة القاضية داين أربوريزيشن المعيبة للأعصاب فرنك في الحجاب الحاجز، مما تسبب في فشل الجهاز التنفسي ووفيات فورا بعد الولادة6،7. ولذلك، هذه الخطوة الأخيرة من النضوج مينيسوتا (أي، الإسقاط محواري والتفريع) أمر حاسم لضمان الاتصال بين الخلايا العصبية والخلايا المستهدفة.
لعرض أنماط أربوريزيشن، الباحثون عادة إجراء تصوير [كنفوكل] أو مجهرية fluorescence اثنين-فوتون الضوء من عينات مقسمة أو الجامعة-جبل8،،من910. كل من هذه التقنيات مجهرية تولد اختراق القرار وعمق مقبولة. الأسفار اثنين-فوتون الخفيفة الميكروسكوب ينطوي على إثارة فلوروفوريس بامتصاص المتزامنة اثنين الطاقة المنخفضة الفوتونات11. منذ يومين-فوتون الإثارة يستخدم الإشعاع بالقرب من الأشعة تحت الحمراء، يسهم الإثارة انخفاض وتيرة انخفاض نثر واختراق الأنسجة أفضل ما يصل إلى 1 مم في الأنسجة، مما يتيح التصوير بعمق أكبر. يزيل مجهرية [كنفوكل] عن طريق المرشحات الخارج التركيز إشارات ويجمع الضوء داخل المستوى البؤري12فقط. مع هذا النهج، يمكن الجمع بين الصور عينات من طائرات تنسيق مختلفة لإنتاج صورة ثلاثية الأبعاد (3D) عن طريق دالة Z-مكدس. ومع ذلك، يتم تقليل كثافة إشارة كما يتم حظر معظم الضوء ويحجب فتحات عددية عالية في العمق من الميدان. الأهم من ذلك، كلا التقنيات المساهمة د شديدة ولالضيائيه نظراً للعينة كلها يتلقى إنارة حتى عندما يتم تصويرها سوى طائرة واحدة في وقت معين.
للالتفاف حول أوجه القصور هذه، أصبح لسفم بديلاً مفضلا، مع مزايا سريعة وفعالة الضوء، وأقل سمي ضيائي13،14. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح لسفم تصوير عرض متعددة. هذا النهج مناسبة خاصة لتصور محاور عصبية المحرك وهذه المحطات تفريق كما أنها تنتشر عبر الفضاء ثلاثي الأبعاد. لسفم يتفوق الخيارين الآخرين لأن عينات تقام على خشبة المسرح الذي يسمح دوران حول محور عمودي والتحركات على طول محاور x و y، و z. لا يسمح هذا الإعداد لطريقة عرض الحد الأدنى محظورة من العينة ولكن أيضا اختيار مسار الإضاءة مستصوبا، عيب من الفحص المجهري اثنين-فوتون و [كنفوكل]، كلاهما يتطلب تركيب العينات على شريحة مسطحة. ولذلك، لسفم هو الأداة الأكثر ملاءمة لتصوير ثلاثي الأبعاد من أربوريزيشن إكسون والتحديد الكمي للمحطات الطرفية الأعصاب الحركية في الأجنة الماوس.
Protocol
Representative Results
Discussion
عدة خطوات في البروتوكول قد تتعرض لتغيرات في ظروف معينة. على سبيل المثال، مدة التثبيت يعتمد على سن الأجنة، تتراوح بين ح 2 أيام 1 أو أكثر باستخدام بارافورمالدهيد الطازجة. منذ التثبيت تتم قبل كله جبل إيمونوستينينج، للأجسام المضادة التي تكون حساسة للبروتين كروسلينكينج، يمكن استخدام الميثانول…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لسفم التجارب وتحليل البيانات أجريت باستخدام المجاهر الضوئية المتقدمة من “شعبة الخدمة صك” جزئيا في سينيكا، وبالمساعدة من السيدة شين شو-تشن. ونشكر السيدة سو بينغ لي من “التصوير الأساسية مرفق للمكتب البحري الدولي” لقدر كبير من المساعدة التقنية مع تحليل الصورة إيماريس. واستعرض “العلمية الإنجليزية الأساسية” للمكتب البحري الدولي تحرير المخطوطة. وتمول هذا العمل الوظيفي التابع سينيكا الأوساط الأكاديمية جائزة التنمية (الحزب الديمقراطي المسيحي-107-L05)، وآخر (104-2311-B-001-030-MY3)، والمؤسسات الوطنية (المؤسسات الوطنية-EX106-10315NC).
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
