Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden
Summary
Burada, biz bir tekrarlanabilir lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) için bir protokol trabeküler meshwork (TM) aşağı akım RNA analizi için yalıtmak için açıklamak. TM ifadede gen değişiklikleri analiz yeteneği göz hastalıkları TM ile ilgili temel moleküler mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır.
Abstract
Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) gen ifade analizi tek hücre izin ve hücre popülasyonlarının doku bölümlerde zenginleştirilmiş. LCM hücre farklılaşma ve geliştirme ve glokom da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesini temel moleküler mekanizmaları incelenmesi için harika bir araçtır. Glokom, ilerici optik neuropathies bir ailenin oluşur, geri dönüşü olmayan körlüğü dünya çapında en sık nedenidir. Yapısal değişiklikler ve trabeküler meshwork (TM) içinde hasar glokom geliştirmek için önemli bir risk faktörü olan göz içi basınç artışı (gib), neden olabilir. Ancak, hassas moleküler mekanizmaları dahil hala kötü anlaşılır. Gen ifade analizi gerçekleştirme olanağı daha fazla bu hücreler ve rolünü IOP ve glokom gelişme Yönetmelikte işlevi anlayışlar elde etmek çok önemli olacak. Bunu başarmak için RT-qPCR ve RNA-Seq gereklidir gibi son derece izole bir tekrarlanabilir Yöntem TM fare gözler ve bir yöntemi için aşağı akım gen ifade analizi, donmuş bölümlerden zenginleştirilmiş. Burada açıklanan yöntemi son derece saf TM fare gözlerinden aşağı akım dijital PCR ve Mikroarray analiz için izole etmek için geliştirilmiştir. Buna ek olarak, bu Teknik yalıtım diğer zenginleştirilmiş oküler hücreleri ve fare gözlerinden izole etmek zordu hücre bölmeleri için kolayca adapte edilebilir. LCM ve RNA Analizi kombinasyonu glokom temel hücresel olaylar daha kapsamlı bir anlayış için katkıda bulunabilir.
Introduction
Glokom optik nöropati ve sonuçta geri dönüşü olmayan körlüğü1,2‘ ye giden retinopati karakterize hastalıklar grubudur. Bu tarafından 2020 over 70 milyon kişi dünya çapında hastalığı3,4,5,6,7çeşit ile yaşıyor olacak tahmin edilmektedir. Birincil açık açılı glokom (POAG), glokom, en yaygın türü göz içi basınç artışı (gib)8,9,10‘ aönde gelen sulu mizah (AH) çıkış bir azalma ile karakterize, 11,12,13,143,15,16,17,18. Sol tedavi edilmezse, kronik olarak yükseltilmiş IOP retina ve radyal körlüğü1,2,19neden optik sinir başı ilerici ve geri dönüşü olmayan zarar yol açar. Glokom gib, silier vücut tarafından Ah üretim hızını azaltarak veya bu çıkış1,8,9, artırılması tarafından azaltma konusuna önem ilerlemesini yavaşlatmak için tüm geçerli yöntemleri 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabeküler meshwork (TM) aktif olarak birincil AH çıkım yolu düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve uygunsuz işlevini hipertansif glokom1,2,19için sorumlu bir faktördür. Ancak, TM disfonksiyon ve nasıl AH drenaj düzenleyen ilişkili moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılmış değil ve şu anda önemli bir odak noktası glokom araştırma1,2,19, 20. çeşitli genom çapında dernek çalışmaları (GWAS) glokom ve TM AH çıkım tesisinde artan direnç genleri bir dizi bağladığınız iken hastalığı yol değildir tam moleküler mekanizmalar henüz tam olarak21 anlayamadım , 22 , 23 , 24 , 25.
Hayvan modelleri büyük ölçüde geçerli bilgimizi (3,15,16,26,27,28‘, kapsamlı bir şekilde gözden glokom hastalığın ilerlemesinde gelişmiş var. 29,30,31,32,33). TM34,35,36 çalışmaya çeşitli öncü yöntemler geliştirilmiştir ve bu yöntemler yaygın olarak normal ve hastalıklı doku geçerli bizim anlayışı ilerletmek için kullanılmıştır. Değil kapsamlı bir şekilde araştırılmalıdır bir alan TM başarısızlık moleküler mekanizmaları incelemek için genetik olarak değiştirilmiş fare modellerinin kullanımı olduğunu. Transgenik knock ve knock-out fare çalışmaları gibi Myocilin (Myoc)37,38 ve Cyp1b139, TM ilişkili genlerin TM moleküler mekanizmaları eğitim için birincil araçlar olmuştur işlev. Anlaşılır, farelerde TM küçük boyutlu bu doku çalışmaya başlamak için aşılması gereken ciddi bir engel temsil eder. Fare modelleri LCM teknolojik gelişmeler TM dahil olmak üzere en küçük ve en hassas dokuları çalışma güçlendirmek için gerekli araçları sunarken genetik ve moleküler mekanizmaları hastalık, eğitim için güçlü bir araç temsil eder.
Bu raporda, sonraki RNA izolasyon ve güçlendirme için aşağı akım ifade analizi ile birlikte fare gözlerinden zenginleştirilmiş TM LCM için sağlam ve tekrarlanabilir yöntemi açıklanmıştır. Benzer Yöntem başarıyla farelerde göz dokularının40,41,42,43,44diğer türleri yalıtmak için kullanılmıştır, burada bildirilen metodoloji diğerine uygulanabilir RNA, mikroRNA, DNA ve proteinler çalışmaya göz ayrı dokuların. Önemlisi, bu teknik TM bozukluğu glokom ve oküler hastalığı3,15,16,17 moleküler patogenezi daha iyi anlamak için genetik olarak değiştirilmiş fare kullanımı sağlar ,18,26,31,45,46. Yeteneğini LCM fare gözlerle TM izole etmek-ecek var olmak daha fazla birkaç oküler hastalıkların moleküler mekanizmaları anlayışlar elde yararlı bir yöntem.
Protocol
Representative Results
Discussion
TM aktif olarak homeostatik IOP korumada önemli bir rol oynar ve onun disfonksiyon yaygın hipertansif glokom1,2,19ana etken faktör olarak kabul edilir. Tek nükleotid polimorfizmleri çeşitli genlerde GWAS analiz tarafından tanımlanan bir dizi artan Glokom riski ve TM AH çıkım tesisinde artan direnç bağlantılı olmuştur; Ancak, bu hastalığın ortaya çıkmasına kesin moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
References
- Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
- Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
- Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
- Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
- . Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
- . The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
- . The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
- Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
- Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
- Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
- Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
- Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
- Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
- John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
- Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
- Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
- Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
- Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
- Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
- Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
- Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
- Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
- Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
- Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
- Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
- Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
- Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
- Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
- Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
- Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
- Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
- Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
- Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
- Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
- Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
- Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
- Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
- Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
- Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
