Onderzoek naar Teliospore kieming met behulp van Microrespiration analyse en Microdissection
Summary
Smut schimmels veroorzaken vele verwoestende landbouw ziekten. Zij worden verspreid als slapende teliospores die in antwoord op het milieu signalen ontkiemen. Duidelijk naar voren komt twee methoden voor het onderzoek naar moleculaire veranderingen tijdens kieming: meten van verhoging van de ademhaling voor het detecteren van metabole activering en beoordelen van moleculaire gebeurtenissen wijzigen door het isoleren van teliospores in verschillende morfologische stadia.
Abstract
Smut schimmels zijn de etiologische agenten van verschillende verwoestende landbouw ziekten. Ze worden gekenmerkt door de productie van teliospores, die verspreiding dikwandige agenten. Teliospores kunnen slapende blijven voor decennia. De rustperiode wordt gekenmerkt door lage stofwisseling, onderbroken macromoleculaire biosynthese en sterk verlagingen van de ademhaling. Na ontvangst vereist Milieusignalen, ontkiemen teliospores te produceren haploïde cellen, die dit leiden nieuwe rondes van infectie tot kunnen. Teliospore kiemkracht wordt gekenmerkt door de hervatting van de macromoleculaire biosynthese, verhoogde ademhaling en dramatische morfologische veranderingen. Om te precies meten veranderingen in cellulaire ademhaling tijdens de vroege stadia van kiemkracht, hebben we een eenvoudig protocol met een Clark-type respirometer ontwikkeld. De latere stadia van kiemkracht worden onderscheiden door specifieke morfologische veranderingen, maar kiemkracht asynchroon is. We ontwikkelden een techniek van de microdissection waarmee we kunnen verzamelen van teliospores in verschillende kiemkracht stadia.
Introduction
De vuiligheid schimmels (Ustilaginales) bestaan uit meer dan 1600 soorten die grassen met inbegrip van de belangrijke graan, maïs, gerst en tarwe infecteren, waardoor miljarden dollars in gewas verliezen jaarlijks1. Deze schimmels worden gekenmerkt door de productie van teliospores, die hebben darkly gepigmenteerde celwanden en de versnippering agenten. Teliospores functie voor het beschermen van genetisch materiaal tijdens de stress van verspreiding tussen waardplanten, en in een slapende toestand van jaar2kan aanhouden. Zo, zijn teliospores een essentieel onderdeel van de verspreiding van de ziekte.
Om te kunnen studeren teliospore biologie, ons laboratorium maakt gebruik van de model smut schimmel Ustilago maydis (U. maydis), oftewel het oorzakelijke agens van de ziekte ‘gemeenschappelijk vuiligheid van maïs’. Oudere U. maydis teliospores worden gekenmerkt door groei arrestatie, verminderde cellulaire metabolisme en lage niveaus van cellulaire ademhaling3. In gunstige milieu-omstandigheden (bijv., de aanwezigheid van specifieke suikers), U. maydis teliospores ontkiemen en voltooien van meiose, produceren basidiospores, die dit leiden nieuwe rondes van infectie tot kunnen. Kieming wordt gekenmerkt door de verhoogde ademhaling, de terugkeer naar de metabole activiteit en de progressie door waarneembare morfologische stadia van kiemkracht4.
De eerste fase van kiemkracht omvat verhoogde ademhaling en metabole functie, er zijn echter geen morfologische aanwijzingen van verandering. De oorspronkelijke metingen van respiratoire verandering in U. maydis werden uitgevoerd meer dan 50 jaar geleden, meten van zuurstofverbruik manometrically met een Warburg kolf apparaat5. We hebben een nieuwe, eenvoudige methode voor het bestuderen van de precieze veranderingen in de ademhaling tijdens de kieming van het teliospore door het meten van zuurstofverbruik over een tijdsverloop van kieming met behulp van een Clark-type microrespirometer ontwikkeld. Wij eerder gebruikt deze methode bij het bestuderen van de veranderingen in respiratoire tarief tussen wild-type U. maydis haploïde cellen en mutanten met defecte mitochondriën6, en hebben het protocol hier aangepast om veranderingen in teliospore ademhaling tijdens studie kieming. Dit biedt een manier om de timing van ademhaling verandering nauwkeurig te identificeren zodat we teliospores op het juiste moment na de inleiding van kieming richten kunnen te onderzoeken van vroege moleculaire gebeurtenissen. De progressie van kieming kan microscopisch worden gevolgd, zodra de promycelia naar voren uit de teliospore komt, maar de asynchrone aard geremd het isolement van genoeg teliospores op een gegeven moment voor onderzoek. Wij ontwikkelden een microdissection techniek vergelijkbaar met die voor in vitro bevruchting gewend fysiek teliospores te verzamelen in verschillende morfologische stadia van kiemkracht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lange biotrophic plant ziekteverwekkers worden jaarlijks miljarden dollars in gewas verliezen veroorzaken. De overgrote meerderheid van deze ziekteverwekkers produceren teliospores, die integraal deel van de schimmel versnippering en geslachtelijke voortplanting uitmaken. Verkrijgen van kennis van de ontwikkeling en de kiemkracht van teliospores is van cruciaal belang voor het begrip van de verspreiding van de verwoestende ziekten veroorzaakt door deze schimmels. Teneinde de moleculaire veranderingen op belangrijke contr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Dr. Paul Frost voor gebruik van zijn microrespirometer, en Nicole Wagner en Alex Bell voor technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van NSERC naar B.J.S.
Materials
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E., Swan, A. . Meiosis – Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. , 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. . Monograph Number 2. , (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. . Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , (2013).
- Fröhlich, J., König, H., König, H., Varma, A. . Soil Biology – Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. , 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
