Inducción del síndrome nefrótico en ratones por la inyección Retrobulbar de la doxorrubicina y la prevención de la retención de volumen por la aprotinina de liberación sostenida
Summary
Aquí, describimos la inducción del síndrome nefrótico experimental en ratones 129S1/SvImJ por inyección retrobulbar rápido de doxorrubicina. También tratamos ratones nefróticos con gránulos de liberación prolongada que contiene aprotinina para inhibir la actividad de la proteasa de serina urinaria y prevenir la retención de sodio.
Abstract
El síndrome nefrótico es la manifestación más extrema de la enfermedad renal proteinuria y caracterizada por proteinuria pesado, hipoalbuminemia y edema por retención de sodio y la hiperlipidemia. Para estudiar la fisiopatología de este síndrome, roedor han desarrollado modelos basados en la inyección de sustancias tóxicas como la doxorrubicina causando daño Podocito. En los ratones, sólo algunas cepas son susceptibles a este modelo. En los ratones de tipo salvaje 129S1/SvImJ, la administración de doxorubicina por inyección intravenosa rápida en el seno de retrobulbar induce síndrome nefrótico experimental que presenta todos los síntomas de las enfermedades humanas, incluyendo edema y retención de sodio. Después de la aparición de proteinuria, exposición de ratones aumentó actividad de proteasa de serina urinaria que conduce a la activación del canal epitelial del sodio (ENaC) y retención de sodio. Inhibición farmacológica de las proteasas de serina urinaria por el tratamiento con aprotinina de liberación sostenida abroga la activación de ENaC y evita la retención de sodio. Este modelo es ideal para el estudio de la fisiopatología de la proteasuria, es decir., la excreción de las proteasas de serina activa que causa la activación de ENaC por la proteolisis de la subunidad γ. Esto puede considerarse como el mecanismo primario de activación de ENaC y la retención de sodio en enfermedad renal proteinúrica.
Introduction
El síndrome nefrótico se caracteriza por hiperlipemia, hipoalbuminemia, edema y proteinuria pesado y puede considerarse como la manifestación más extrema de la enfermedad renal proteinúrica. En roedores, el síndrome nefrótico experimental puede ser inducido por una inyección de antraciclinas o puromicina que conduce al daño Podocito y se asemeja a la enfermedad humana cambios mínimos y glomerulosclerosis segmentario focal (FSGS)1. Después de su primera descripción en 1955 por Frenk et al. 2, nefrosis de nucleósido puromicina (PAN) en ratas se ha convertido en un modelo estándar para investigar la fisiopatología del síndrome nefrótico en numerosos estudios3,4,5,6. En ratones, el modelo puede ser inducido por la antraciclina doxorrubicina7. Sin embargo, hay una fuerte dependencia de cepa que está genéticamente determinada por al menos dos loci genéticos8. Además, existen diferencias en la respuesta de proteinuria y el curso del síndrome nefrótico9,10. Usando ratones 129S1/SvImJ y la inyección intravenosa rápida de doxorrubicina vía el seno retrobulbar, respuestas de proteinuria alcanzan valores que son suficientes para inducir las características típicas del síndrome nefrótico, especialmente retención de volumen caracterizado por ascitis y casi libre de sodio orina7. Retención de sodio en el síndrome nefrótico experimental ha sido presumida para ser el resultado de la activación del canal epitelial del sodio (ENaC) en el túbulo distal por las proteasas de serina aberrantemente filtrada como plasmina causa proteólisis de la subunidad γ4 ,11,12. Recientemente, este concepto fue probado en ratones nefróticos que estaban protegidos de proteolytic activación de ENaC y la retención de sodio por el tratamiento con la aprotinina de inhibidor de proteasa de serina que era igualmente eficaz como el ENaC bloqueador amilorida13. Para asegurar la continua entrega a los túbulos distales, aprotinina fue administrada mediante pellets de liberación sostenida por vía subcutánea implantado. Se necesitan estudios futuros para identificar las proteasas de serina que son responsables de la activación proteolítica de ENaC en el síndrome nefrótico que se cree que la situación humana en paralelo. Para ello, el síndrome nefrótico inducida por la doxorrubicina es un modelo valioso que puede ser utilizado en los ratones de tipo salvaje o ampliado a ratones modificados genéticamente. Sus ventajas incluyen bajo costo de la droga, menor complejidad de la gestión y buena reproducibilidad14.
En este artículo, nos demuestran la inducción del síndrome nefrótico experimental por inyección intravenosa rápida de la doxorrubicina al sino retrobulbar y la implantación de pellets de liberación sostenida que contienen aprotinina para inhibir la proteasa de serina urinaria actividad medida con un ensayo cromogénico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, demostramos que la doxorrubicina inyectable vía la inyección retrobulbar del seno induce síndrome nefrótico experimental en ratones 129S1/SvImJ con proteinuria, retención de sodio, hypoalbumenia y la hiperlipidemia. Sin embargo, hay dos cuestiones fundamentales que han de tenerse en cuenta al utilizar este modelo. En primer lugar, la inducción del modelo es estrictamente dependientes de la dosis y desviaciones de la dosis de doxorrubicina tan pequeñas como 0.3 μg/g afectan la respuesta de los ratones<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación de investigación alemana (DFG, AR 1092/2-1).
Materials
| supplies | |||
| BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm) | BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany | PZN: 07468060 | syring |
| ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) | Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany) | EH7823H | suture |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| aprotinin (6000 KIU/mg) | LOXO, Heidelberg, Germany | CAS 9087-70-1 | |
| Bepanthen, Augen- und Nasensalbe | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN: 1578681 | ointment |
| Chromogenix S-2251 | HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany | 82 0332 39 | chromogenic substrate |
| doxorubicin (2.0 µg/µL) | Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany | CAS 25316-40-9 | doxorubicin |
| isofluran CP (1 mL/mL) | CP-Pharma, Burgdorf, Germany | CAS 26675-46-7 | isofluran |
| pellets with matrix-driven sustained release (custom-made) | Innovative Research of America, Sarasota, FL | X-999 | pellet |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| equipment | |||
| ELx808 Absorbance Mikroplate Reader | BioTek, Bad Friedrichshall, Germany | ELx808 | microplate reader |
| MICROSTERIL – 436 | B.M.S., Trescore Balneario, Italy | GAL/436 | sterilizer |
| Hybridization oven/shaker | GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK | RPN 2511 | heat chamber |
| Thermo MAT Pro 10 W, 15×25 cm, Lucky Reptile | Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany | 61201 | mouse warming device |
References
- Lee, V. W., Harris, D. C. Adriamycin nephropathy: a model of focal segmental glomerulosclerosis. Nephrology (Carlton). 16 (1), 30-38 (2011).
- Frenk, S., Antonowicz, I., Craig, J. M., Metcoff, J. Experimental nephrotic syndrome induced in rats by aminonucleoside; renal lesions and body electrolyte composition. Proc Soc Exp Biol Med. 89 (3), 424-427 (1955).
- Ichikawa, I., et al. Role for intrarenal mechanisms in the impaired salt excretion of experimental nephrotic syndrome. J Clin Invest. 71, (1983).
- Deschenes, G., Wittner, M., Stefano, A., Jounier, S., Doucet, A. Collecting duct is a site of sodium retention in PAN nephrosis: a rationale for amiloride therapy. J Am Soc Nephrol. 12 (3), 598-601 (2001).
- Lourdel, S., et al. Hyperaldosteronemia and activation of the epithelial sodium channel are not required for sodium retention in puromycin-induced nephrosis. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3642-3650 (2005).
- Seigneux, S., Kim, S. W., Hemmingsen, S. C., Frokiaer, J., Nielsen, S. Increased expression but not targeting of ENaC in adrenalectomized rats with PAN-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 291 (1), F208-F217 (2006).
- Artunc, F., et al. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 in doxorubicin-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (6), F1624-F1634 (2008).
- Zheng, Z., et al. A Mendelian locus on chromosome 16 determines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2502-2507 (2005).
- Kimura, M., et al. Interstrain differences in murine daunomycin-induced nephrosis. Nephron. 63 (2), 193-198 (1993).
- Wang, Y., Wang, Y. P., Tay, Y. C., Harris, D. C. Progressive adriamycin nephropathy in mice: sequence of histologic and immunohistochemical events. Kidney Int. 58 (4), 1797-1804 (2000).
- Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20 (2), 299-310 (2009).
- Passero, C. J., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. New role for plasmin in sodium homeostasis. Curr Opin Nephrol Hypertens. 19 (1), 13-19 (2010).
- Bohnert, B. N., et al. Aprotinin prevents proteolytic epithelial sodium channel (ENaC) activation and volume retention in nephrotic syndrome. Kidney Int. 93 (1), 159-172 (2018).
- Pippin, J. W., et al. Inducible rodent models of acquired podocyte diseases. Am J Physiol Renal Physiol. 296 (2), F213-F229 (2009).
- Bohnert, B. N., et al. Impact of phosphorus restriction and vitamin D-substitution on secondary hyperparathyroidism in a proteinuric mouse model. Kidney Blood Press Res. 40 (2), 153-165 (2015).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
- Beath, S. M., et al. Plasma aprotinin concentrations during cardiac surgery: full- versus half-dose regimens. Anesth Analg. 91 (2), 257-264 (2000).
- Kanter, P. M., et al. Preclinical toxicology study of liposome encapsulated doxorubicin (TLC D-99): comparison with doxorubicin and empty liposomes in mice and dogs. In Vivo. 7 (1), 85-95 (1993).
- Ma, L. J., Fogo, A. B. Model of robust induction of glomerulosclerosis in mice: importance of genetic background. Kidney Int. 64 (1), 350-355 (2003).
- Kren, S., Hostetter, T. H. The course of the remnant kidney model in mice. Kidney Int. 56 (1), 333-337 (1999).
- Mizuno-Horikawa, Y., Mizuno, S., Tamura, S., Kurosawa, T. Advanced glomerulosclerosis is reversible in nephrotic mice. Biochem Biophys Res Commun. 284 (3), 707-713 (2001).
- Friberger, P. Chromogenic peptide substrates. Their use for the assay of factors in the fibrinolytic and the plasma kallikrein-kinin systems. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 162, 1-298 (1982).
- Haerteis, S., et al. Plasma kallikrein activates the epithelial sodium channel in vitro but is not essential for volume retention in nephrotic mice. Acta Physiologica. , (2018).
- Schork, A., et al. Association of Plasminuria with Overhydration in Patients with CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 11 (5), 761-769 (2016).
