Summary

Microscopía de luz de hoja para la visualización tridimensional de las células inmunes humanas

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar células inmunes embebidas en una matriz de colágeno (3D) tridimensional mediante microscopía de luz de hoja. Este protocolo también explica cómo realizar el seguimiento de la migración celular en 3D. Este protocolo puede ser empleada para otros tipos de suspensión de células en la matriz 3D.

Abstract

In vivo, la activación, proliferación y función de las células inmunes todos se producen en un entorno tridimensional (3D), por ejemplo en los ganglios linfáticos o tejidos. Hasta la fecha, la mayoría en vitro sistemas se basan en dos dimensiones (2D) las superficies, como las placas de cultivo celular o cubreobjetos. A óptimo imitan las condiciones fisiológicas en vitro, utilizamos una matriz de colágeno 3D simple. Colágeno es uno de los principales componentes de la matriz extracelular (ECM) y ha sido ampliamente utilizado para constituir matrices de 3D. Para la proyección de imagen 3D, la tecnología de microscopia de luz hoja recientemente desarrollado (también conocida como microscopía de iluminación solo plano) se presenta con alta velocidad, la profundidad de penetración grande, blanqueo bajo y fotocitotoxicidad. Además, microscopia de la hoja de luz es particularmente ventajosa para medición a largo plazo. Aquí se describe un protocolo optimizado cómo configurar y manejar las células inmunes humanas, por ejemplo primario humano los linfocitos T citotóxicos (CTL) y las células natural killer (NK) en la matriz de colágeno 3D para uso con la microscopia de luz-hoja para la proyección de imagen de células vivas y muestras fijadas. Se presentan el procedimiento de adquisición de imágenes y análisis de la migración de la célula. Especial atención se da a resaltar pasos críticos y los factores para preparación de muestras y análisis de datos. Este protocolo puede ser empleada para otros tipos de suspensión de células en una matriz de colágeno 3D y no se limita a las células inmunes.

Introduction

Más conocimiento acerca de la migración las células viene de 2D1,2,3, los experimentos que se realizan normalmente en una superficie de vidrio o plástico de una cultura/proyección de imagen de plato. Sin embargo, una situación fisiológica requiere, en la mayoría de los casos, un microambiente 3D, en el que la matriz extracelular (ECM) juega un papel decisivo. ECM no sólo proporciona lo esencial de la estructura en 3D para mantener la morfología de la célula adecuada sino también ofrece señales de supervivencia o las señales direccionales para un óptimo funcionamiento de muchas células4,5 . Por lo tanto, un entorno 3D es necesario para identificar mejor las funciones celulares y comportamiento en un entorno que mejor reflejan el contexto fisiológico.

En el cuerpo humano, la mayoría de las células especialmente las células inmunes, ejercen sus funciones bajo un escenario 3D. Por ejemplo, las células T activadas patrullan tejidos buscando las células blanco, células ingenuas T migran a través de los ganglios linfáticos en busca de sus cognadas células presentadoras de antígeno, durante la cual el modo de migración y las máquinas se adaptan a las correspondientes extracelular medio ambiente3,6,7. El gel de colágeno 3D ha sido ampliamente utilizado como un 3D bien establecidas y bien caracterizadas de la célula cultura sistema8,9,10. Nuestro trabajo previo demuestra que los linfocitos humanos primarios son muy móviles y migran a una velocidad promedio de aproximadamente 4.8 μm/min en una matriz de colágeno de 0.25%11. Reordenamiento del citoesqueleto desempeña un papel clave en la migración celular del12. La acumulación de pruebas demuestra que los linfocitos no se aplican solamente un solo modo de la migración pero pueden alternar con cierto comportamiento de migración dependiendo de la ubicación, microambiente, citoquinas, gradientes quimiotácticos, señales extracelulares que tune la comportamiento migratorio en diferentes formas 3.

Para analizar con fiabilidad las funciones inmunes celulares y comportamiento, por ejemplo, migración, formación de las protuberancia o transporte vesicular, es de gran ventaja ser capaz de adquirir imágenes en volúmenes relativamente grandes de 3D de manera rápida y confiable. Para la proyección de imagen 3D, la tecnología de microscopia de luz hoja recientemente desarrollado (también conocida como microscopía de iluminación solo plano) ofrece una solución satisfactoria13,14. Durante la adquisición de imágenes, se genera una hoja fina de luz estática para iluminar la muestra. De esta manera, en el plano de enfoque, un área grande se puede iluminar al mismo tiempo sin afectar las células off-plane. Esto permite una alta velocidad con un blanqueo drásticamente reducida y la fotocitotoxicidad. En este papel, describimos cómo visualizar las células inmunes humanas primarias mediante microscopía de luz de hoja y cómo analizar la migración en un escenario 3D.

Protocol

Investigación realizada para este estudio con el material humano (cámaras sistema reducción de leucocitos de donantes de sangre humana) está autorizado por el Comité de ética local (declaración de 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) y sigue las pautas correspondientes. 1. preparación de solución de colágeno neutralizado (500 μl) Transfiera 400 μL de solución stock de colágeno refrigerado (10,4 mg/mL) a un tubo de 1,5 mL estéril debajo de la campana de la cult…

Representative Results

Formación saliente durante la migración de la célula de T es un proceso altamente dinámico, que es dependiente de actina. Para visualizar la formación saliente del CTL humana primaria, nos transfectadas transitoriamente una proteína mEGFP fundido para etiquetar el citoesqueleto de actina en CTL como se describe antes del11. Un día después de la transfección, las células fueron embebidas en la matriz de colágeno. Pilas de imágenes fueron adquiridas cada …

Discussion

Mayoría en vitro ensayos se llevan a cabo sobre una superficie 2D, por ejemplo en las placas de cultivo celular, platos de Petri o en cubreobjetos, mientras que en vivo las células, especialmente las células inmunes, sobre todo un microambiente 3D la experiencia. Emergentes de la evidencia muestran que los patrones de migración de células inmunes diferencian entre 2D y 3D escenarios17. Por otra parte, los perfiles de expresión de las células tumorales también son diferent…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Instituto de Hemostaseology clínica y medicina de la transfusión para proporcionar sangre dispensadora de aceite; Carmen Hässig y Cora Hoxha excelente ayuda técnica. Agradecemos a Jens Rettig (Universidad de Saarland) para el vector modificado pMAX, Roland Wedlich-Söldner (Universidad de la Münster) para la construcción original de la LifeAct-Ruby y Christian Junker (Universidad de Saarland) para generar la construcción de LifeAct-mEGFP. Este proyecto fue financiado por Sonderforschungsbereich 1027 (proyecto A2 B.Q.) y 894 (proyecto A1 M.H.). El microscopio de luz de hoja fue financiado por DFG (GZ: INST 256/4 19 1 FUGG).

Materials

Fibricol, bovine collagen solution Advanced Biomatrix  #5133-20ML Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution Merck 1091381000 for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose Affymetrix 32821-10GM Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit Thermo Fisher 11348D Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation Thermo Fisher 11132D Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2 Thermo Fisher PHC0023 Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit Lonza V4XP-30XX Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG Abcam ab124904 IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin Thermo Fisher A22284 IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain Thermo Fisher C10045 Fluorescent cell label
Tween 20 Sigma P1379-250mL IF
Triton X-100 Eurobio 018774 IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline Thermo Fisher 14190250 IF
Bovine serum albumin Sigma A9418-100G IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit Thermo Fisher A-11011 IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) Zeiss N.A.
Cell culture hood Thermo Fisher HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i  Thermo Fisher N.A.
Centrifuge 5418 and 5452 Eppendorf N.A.
Pippettes Eppendorf 3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips VWR 89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubes Sarstedt  62.554.002
Capillaries 50 µL VWR (Brand) 613-3373 Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries VWR (Brand) BRND701934 "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips Merck 1095430001 to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes BD Z230723 ALDRICH Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) Play-Doh N.A.
Imaris file converter Bitplane available at http://www.bitplane.com  Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) Bitplane available at http://www.bitplane.com  Analysis of 3D and 4D imaging data

References

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Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., Qu, B. Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells. J. Vis. Exp. (136), e57651, doi:10.3791/57651 (2018).

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