Intracranica Subarachnoidal itinerario dell'infezione per indagare ruoli di biofilm di Streptococcus suis nella meningite in un modello di infezione del topo
Summary
Qui, descriviamo l’itinerario subarachnoidal intracranica dell’infezione nei topi per studiare i ruoli dei biofilm nella meningite Streptococcus suis . Questo modello di infezione è anche adatto per studiare la patogenesi di altre meningite batterica e l’efficacia di nuovi farmaci contro la meningite batterica.
Abstract
Streptococcus suis è non solo un importante agente patogeno batterico di suini in tutto il mondo, ma anche un agente zoonotico emergente. In esseri umani e maiali, la meningite è una manifestazione importante di infezioni da S. suis . Un modello di infezione adatto è uno strumento essenziale per comprendere i meccanismi delle malattie causate da agenti patogeni. Diversi itinerari dell’infezione nei topi sono stati sviluppati per studiare la patogenesi dell’infezione da S. suis . Tuttavia, i percorsi intraperitoneali, intranasali ed endovenosa dell’infezione non sono adatti per studiare i ruoli dei componenti di superficie di S. suis nella meningite direttamente nel cervello, come la matrice extracellulare da biofilm. Anche se l’inoculazione intracisternal è stato utilizzato per infezione da S. suis , il sito di iniezione precisa non è stata descritta. Qui, l’itinerario di subarachnoidal intracranica dell’infezione è stata descritta in un modello murino per studiare i ruoli di biofilm in S. suis meningite. S. suis cellule planctoniche o biofilm dello stato sono stati iniettati direttamente nello spazio subaracnoideo dei topi attraverso il sito di iniezione si trova 3,5 mm rostrale dal bregma. L’analisi istopatologica e aumentata espressione di mRNA di TLR2 e citochine del tessuto cerebrale da topi iniettati con le cellule di biofilm stato indicato chiaramente che S. suis biofilm svolge ruoli definitivi in S. suis meningite. Questo itinerario dell’infezione ha evidenti vantaggi rispetto ad altre vie di infezione, permettendo lo studio dell’interazione ospite-batterio. Inoltre, esso consente l’effetto di componenti batteriche sulla risposta immune dell’ospite direttamente nel cervello per essere valutati e imita ingresso batterica nel sistema nervoso centrale. Questo itinerario dell’infezione può essere esteso per indagare i meccanismi della meningite causate da altri batteri. Inoltre, può anche essere utilizzato per testare l’efficacia di farmaci contro la meningite batterica.
Introduction
Streptococcus suis (S. suis) è un importante agente patogeno batterico di suini in tutto il mondo, causando gravi malattie tra cui la meningite, polmonite, setticemia, endocardite e artrite1. È anche un agente zoonotico emergente. Finora, è stato segnalato che nove sierotipi possono causare infezione in esseri umani, compreso i sierotipi 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 e 312,3,4. In esseri umani e maiali, la meningite è uno dei principali segni clinici delle infezioni da S. suis . In Vietnam e Thailandia, S. suis è la principale causa della meningite in adulti5. Biofilm microbici sono microrganismi che aderiscono a vicenda e sono concentrati in un’interfaccia; Essi sono essenziali per la virulenza batterica, sopravvivenza in ambienti diversi e Antibiotico-resistenza5. I biofilm sono in genere circondati da una matrice extracellulare che generalmente contiene polisaccaridi, proteine e DNA6. Quest’ultimo è in grado di suscitare la risposta infiammatoria dell’ospite e di produzione di citochina7. Formazione di biofilm è stata segnalata per essere coinvolti nella meningite streptococcica in studi precedenti. Biofilm contribuiscono alla meningite da Streptococcus agalactiae in un modello di pesce tilapia e formazione di biofilm è stato rivelato all’interno dei tessuti del cervello e nei dintorni di meningea superfici in vivo attraverso Inoculazione intra-addominale8. Durante la meningite, lo streptococco pneumoniae è in uno stato di biofilm e batteri in un tale stato di biofilm erano più efficaci nell’induzione della meningite in un modello di infezione del mouse9. Inoltre, nel nostro precedente studio, lo stato di biofilm associato S. suis nel cervello del topo contribuisce alla virulenza batterica di sopravvivenza analisi10. Tuttavia, la prova diretta per il coinvolgimento di biofilm in S. suis meningite richiede ulteriori indagini.
Modelli animali di infezione da S. suis sono stati sviluppati nei topi utilizzando intraperitoneale (i.p.)11, intranasale (i.n.)12, endovenosa (i.v.)13e gli itinerari di intracisternal (i.c.) di infezione14, 15 , 16. Tuttavia, le vie di i.p., i.n. e i.v. di infezione non sono adatte per studiare i ruoli dei componenti di superficie di S. suis nella meningite direttamente nel cervello. Questi includono matrice extracellulare da biofilm. Anche se l’inoculazione di i.c. è stato usato per infezione da S. suis , il sito di iniezione precisa non è stata descritta in quei fascicoli. Al contrario, le coordinate stereotassiche del sito di iniezione per inoculazione subarachnoidal intracranica chiaramente è stato descritto in un precedente studio17. Questo ha permesso il facile riconoscimento del punto di inoculazione e più semplicistico protocollo sperimentale. Inoltre, l’itinerario di subarachnoidal intracranica dell’infezione imita ingresso batterica nel sistema nervoso centrale da seni o l’ orecchio medio17e la relazione tra l’orecchio medio e la meningite causata da S. suis è stato dimostrato da Madsen et al.18. Inoltre, applicando l’itinerario subarachnoidal intracranica dell’infezione nei topi, abbiamo dimostrato che S. suis piccolo RNA rss04 contribuisce alla meningite nel nostro precedente studio10.
Nello studio presente, l’itinerario di subarachnoidal intracranica dell’infezione è stato utilizzato nei topi per indagare i ruoli di biofilm in S. suis meningite. Topi sono stati infettati con cellule planctoniche o cellule stato biofilm di S. suis da questo itinerario dell’infezione. L’analisi istopatologica e aumentata espressione di mRNA di TLR2 e citochine dal tessuto di cervello di topi iniettati con le cellule di biofilm stato chiaramente indicato che il biofilm di S. suis contribuisce alla meningite.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’itinerario di subarachnoidal intracranica dell’infezione qui descritto ha ovvi vantaggi sopra altri itinerari dell’infezione. Esso consente ai ricercatori di studiare l’interazione ospite-batterio e l’effetto di componenti batteriche sulla risposta immune dell’ospite direttamente nel cervello, che mimano ingresso batterica nel sistema nervoso centrale. Così, questo itinerario dell’infezione può essere esteso per indagare i meccanismi della meningite causate da altri batteri. Inoltre, può anche essere utilizzato per …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina [2017YFD0500102]; la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina [31572544]; il laboratorio chiave dello stato di biologia eziologico veterinaria [SKLVEB2016KFKT005]; l’agricoltura di Shanghai applicato tecnologia sviluppo programma, Cina [G2016060201].
Materials
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
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