Intrakranielle Subarachnoidal rute for infektion for at undersøge roller af Streptococcus suis biofilm i Meningitis i en musemodel infektion
Summary
Her, beskriver vi ruten intrakranielle subarachnoidal af infektion i mus at studere roller af biofilm i Streptococcus suis meningitis. Denne infektion model er også velegnet til at studere patogenesen af andre bakteriel meningitis og effekten af nye lægemidler mod bakteriel meningitis.
Abstract
Streptococcus suis er ikke kun en stor bakteriel patogen svin på verdensplan, men også en spirende zoonotisk agens. Hos mennesker og grise er meningitis en større manifestation af S. suis infektioner. En egnet infektion model er et vigtigt redskab til at forstå mekanismerne af sygdomme forårsaget af patogener. Flere ruter af infektion i mus er blevet udviklet for at studere patogenesen af S. suis infektion. Ruterne intraperitoneal, intranasal og intravenøs infektion er dog ikke velegnet til at studere roller S. suis overflade komponenter i meningitis direkte i hjernen, såsom den ekstracellulære matrix fra biofilm. Selvom intracisternal podning har været brugt til S. suis infektion, præcise injektionsstedet ikke er blevet beskrevet. Her, blev intrakraniel subarachnoidal rute af infektion beskrevet i en musemodel at undersøge roller af biofilm i S. suis meningitis. S. suis planktoniske celler eller biofilm stat celler blev direkte sprøjtet ind i subaraknoid rummet af mus gennem injektionsstedet beliggende 3,5 mm rostralt fra bregma. Histopatologisk analyse og øget mRNA udtryk af TLR2 og cytokiner af hjernevæv fra musene injiceret med biofilm stat celler tydeligt angivet, S. suis biofilm spiller endelige roller i S. suis meningitis. Denne rute af infektion har åbenlyse fordele i forhold til andre ruter af infektion, giver mulighed for undersøgelse af vært-bakterien interaktionen. Desuden, det tillader bakteriel komponenter indvirkning på værten immunrespons direkte i hjernen til at blive vurderet, og efterligner bakteriel indgangen i det centrale nervesystem. Denne rute af infektion kan udvides for at undersøge mekanismerne af meningitis forårsaget af andre bakterier. Det kan desuden også bruges til at teste effekten af lægemidler mod bakteriel meningitis.
Introduction
Streptococcus suis (S. suis) er en større bakteriel patogen svin på verdensplan, forårsager alvorlige sygdomme herunder meningitis, lungebetændelse, septikæmi, endocarditis, og gigt1. Det er også en spirende zoonotisk agens. Hidtil er blevet rapporteret, at ni serotyper kan forårsage infektion hos mennesker, herunder serotyper 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 og 312,3,4. Hos mennesker og grise er meningitis en af de store kliniske tegn på S. suis infektioner. I Vietnam og Thailand er S. suis den største årsag til meningitis hos voksne5. Mikrobielle biofilm er mikroorganismer, som holde sig til hinanden og er koncentreret på en grænseflade; de er uundværlige for bakteriel virulens, overlevelse i forskellige miljøer og antibiotikaresistens5. Biofilm er typisk omgivet af en ekstracellulære matrix, der generelt indeholder polysaccharider, proteiner og DNA6. Sidstnævnte er i stand til at fremkalde vært inflammatoriske respons og cytokin produktion7. Biofilmdannelse er blevet rapporteret at være involveret i streptokok meningitis i tidligere undersøgelser. Biofilm bidrager til Streptococcus agalactiae meningitis i en tilapia fisk model og Biofilmdannelse er blevet afsløret i hjernen væv og omkring meningeal overflader i vivo gennem intra-abdominal podning8. Under meningitis, Streptococcus pneumoniae er i en biofilm-lignende tilstand og bakterier i en biofilm situation var mere effektiv i inducerende meningitis i en mus infektion model9. Desuden, i vores tidligere undersøgelse, biofilm staten forbundet med S. suis i mus hjernen bidrager til bakteriel virulens af overlevelse analyse10. Dog kræver direkte beviser for biofilm inddragelse i S. suis meningitis yderligere undersøgelser.
S. suis infektion-dyremodeller er blevet udviklet i mus bruger intraperitoneal (i.p.)11, intranasal (i.n.)12, intravenøs (IV)13, og intracisternal (IC) ruterne af infektion14, 15 , 16. i.p., i.n. og i.v. ruterne af infektion er dog ikke velegnet til at studere roller S. suis overflade komponenter i meningitis direkte i hjernen. Disse omfatter ekstracellulære matrix fra biofilm. Selv om IC inokulation blev brugt til S. suis infektion, er præcise injektionsstedet ikke blevet beskrevet i disse papirer. Derimod stereotaxisk koordinaterne for injektionsstedet til intrakraniel subarachnoidal podning er klart blevet beskrevet i en tidligere undersøgelse17. Dette gav let anerkendelse af punktet, podning og mere forsimplede forsøgsplan. Derudover efterligner ruten intrakranielle subarachnoidal af infektion bakteriel indgangen til centralnervesystemet fra bihulerne eller mellemøret17og forholdet mellem mellemøret og meningitis forårsaget af S. suis er blevet påvist ved Madsen mfl18. Derudover anvender ruten intrakranielle subarachnoidal infektion hos mus, har vi vist, at S. suis små RNA rss04 bidrager til meningitis i vores tidligere undersøgelse10.
I nuværende undersøgelse, intrakraniel subarachnoidal rute af infektion blev brugt i mus til at undersøge roller af biofilm i S. suis meningitis. Mus blev smittet med planktoniske celler eller biofilm stat celler af S. suis ad denne vej af infektion. Histopatologisk analyse og øget mRNA udtryk af TLR2 og cytokiner fra hjernevæv af musene injiceret med biofilm stat celler tydeligt angivet, S. suis biofilm bidrager til meningitis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ruten intrakranielle subarachnoidal af infektion beskrevet her har åbenlyse fordele i forhold til andre ruter af infektion. Det giver mulighed for efterforskerne at studere vært-bakterien interaktion og påvirkning af bakteriel komponenter vært immunrespons direkte i hjernen, som efterligner bakteriel indgangen i det centrale nervesystem. Således, denne rute af infektion kan udvides for at undersøge mekanismerne af meningitis forårsaget af andre bakterier. Det kan desuden også bruges til at teste effekten af læge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den nationale nøgle forskning og udvikling Program i Kina [2017YFD0500102]; National Natural Science Foundation i Kina [31572544]; den statslige centrale laboratorium af veterinære ætiologisk biologi [SKLVEB2016KFKT005]; Shanghai landbrug anvendt teknologi udvikling Program, Kina [G2016060201].
Materials
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?. Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
