Subarachnoidal תוך-גולגולתי, תוואי זיהום עבור חוקרים התפקידים של סטרפטוקוקוס suis Biofilms ב דלקת קרום המוח במודל זיהום של עכברים
Summary
כאן, אנו מתארים את המסלול subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום בעכברים ללמוד את התפקידים של biofilms בסטרפטוקוקוס suis דלקת קרום המוח. מודל זיהום זה מתאים גם לימוד בפתוגנזה של אחרים דלקת קרום המוח ואת היעילות של תרופות חדשות נגד דלקת קרום המוח.
Abstract
סטרפטוקוקוס suis הוא לא רק פתוגן חיידקי העיקרי של חזירים ברחבי העולם, אלא גם סוכן שפוגעות המתעוררים. בני אדם, חזירים, דלקת קרום המוח היא ביטוי מרכזי של ס’ suis זיהומים. מודל מתאים לזיהום הוא כלי חיוני להבין את המנגנונים של מחלות הנגרמות על ידי פתוגנים. מספר מסלולים של זיהום בעכברים פותחו ללמוד בפתוגנזה של ס’ suis זיהום. עם זאת, המסלולים בקרום הבטן תוך-אפי, תוך ורידי של זיהום אינם מתאימים ללמוד את התפקידים של רכיבים משטח ס suis דלקת קרום המוח ישירות במוח, כגון מטריצות מ biofilms. למרות intracisternal חיסון זה משמש ס suis זיהום, מדויק ההזרקה לא תואר. . הנה, התוואי subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום תוארה במודל של עכברים לחקור את התפקידים של biofilms ב ס suis דלקת קרום המוח. תאים פלנקטוניים suis ס או תאים המדינה biofilm הוזרקו ישירות לתוך מרחב תת-עכבישי של עכברים דרך ההזרקה ממוקם 3.5 מ מ rostral מ bregma. ניתוח histopathological, ביטוי מוגבר mRNA של TLR2 ו ציטוקינים של רקמת המוח של עכברים הזריק biofilm המדינה תאים לציין בבירור כי ס suis biofilm ממלא תפקידים סופית ב ס suis דלקת קרום המוח. המסלול של זיהום יש יתרונות ברורים על פני נתיבים אחרים של זיהום, המאפשר חקר האינטראקציה מארח-חיידק. יתר על כן, הוא מאפשר את ההשפעה של רכיבים חיידקי על תגובות חיסוניות מארח ישירות במוח לפנות לבדיקה, ולא מחקה חיידקי הכניסה לתוך מערכת העצבים המרכזית. ניתן להאריך את המסלול הזה של זיהום על חקירת המנגנון של דלקת קרום המוח הנגרמת על ידי חיידקים אחרים. בנוסף, זה יכול לשמש גם כדי לבדוק את היעילות של תרופות נגד דלקת קרום המוח.
Introduction
סטרפטוקוקוס suis (ס’ suis) הוא פתוגן חיידקי העיקרי של חזירים ברחבי העולם, גורמות למחלות חמורות כולל דלקת קרום המוח, דלקת ריאות, אלח דם, דלקת פנים הלב, דלקת מפרקים1. . זה גם סוכן שפוגעות המתעוררים. עד כה, דווח כי תשעה אשר נגרמו מהזנים אליהם יכול לגרום לזיהום אצל בני אדם, כולל אשר נגרמו מהזנים אליהם 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24, ו 31-2,–3,–4. בני אדם, חזירים, דלקת קרום המוח הוא אחד הסימנים הקליניים העיקריים של ס’ suis זיהומים. וייטנאם ותאילנד, suis ס הוא הגורם העיקרי של דלקת קרום המוח מבוגרים5. חיידקים פתוגנים המועברים במזון הם מיקרואורגניזמים לדבוק אחד בשני, מרוכזים-ממשק; הם חיוניים עבור התקפה אלימה חיידקי, הישרדות סביבות מגוונות, וכן עמידות לאנטיביוטיקה5. Biofilms מוקפים בדרך כלל מטריצה חוץ-תאית, המכיל בדרך כלל סוכרים, חלבונים ו- DNA6. האחרון הוא מסוגל להפיק תגובות דלקתיות המארח ו- ייצור ציטוקינים7. ביופילמים דווח מעורבים דלקת קרום המוח streptococcal במחקרים קודמים. Biofilms לתרום דלקת קרום המוח agalactiae סטרפטוקוקוס במודל דג אמנון, התגלה בתוך ברקמות המוח ביופילמים סביב קרום המוח משטחים ויוו דרך חיסון אינטרה-בטן8. במהלך דלקת קרום המוח, pneumoniae סטרפטוקוקוס נמצא במצב כמו biofilm, חיידקים במצב כזה biofilm היו יותר יעיל וגורם לדלקת קרום המוח בהעכבר זיהום דגם9. בנוסף, קודמות שלנו לומדים, המדינה biofilm המשויך ס suis במוח העכבר תורמת התקפה אלימה חיידקי על ידי ניתוח הישרדות10. עם זאת, עדות ישירה עבור biofilm מעורבות דלקת קרום המוח suis ס דורש חקירה.
מודלים חייתיים של זיהום suis ס פותחו בעכברים באמצעות בקרום הבטן (i.p.)11, תוך-אפי (i.n.)12, תוך ורידית (עירוי)13המסלולים intracisternal (אי. סי) של זיהום14, 15 , 16. עם זאת, המסלולים i.p. i.n., עירוי של זיהום אינם מתאימים ללמוד את התפקידים של רכיבים משטח ס suis דלקת קרום המוח ישירות במוח. אלה כוללים מטריצה חוץ-תאית מ biofilms. למרות חיסון הנצרך שימש ס suis זיהום, ההזרקה מדויק תואר לא בעיתונים האלו. לעומת זאת, הקואורדינטות stereotaxic של ההזרקה עבור חיסון subarachnoidal תוך-גולגולתי בבירור תואר המחקר הקודם17. פעולה זו מותרת זיהוי קל של הנקודה חיסון, יותר פשטני נסיוני. בנוסף, תוואי subarachnoidal תוך-גולגולתי זיהום מחקה חיידקי הכניסה לתוך מערכת העצבים המרכזית את הסינוסים או באוזן התיכונה17, ואת הקשר בין האוזן התיכונה לבין דלקת קרום המוח הנגרמת על ידי suis ס הוכח על ידי מדסן ואח18. יתר על כן, על-ידי החלת התוואי subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום בעכברים, הראו כי ס’ suis rss04 RNA קטנים תורמת דלקת קרום המוח שלנו המחקר הקודם10.
בהווה לומדים, שימש את נתיב subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום בעכברים כדי לחקור את התפקידים של biofilms ב ס suis דלקת קרום המוח. עכברים נדבקו בנגיף פלנקטוניים תאים או biofilm תאים המדינה של ס’ suis דרך זו של זיהום. ניתוח histopathological וביטוי mRNA מוגברת של TLR2, ציטוקינים מרקמות המוח של עכברים הזריק biofilm המדינה תאים לציין בבירור כי ס’ suis biofilm תורמת דלקת קרום המוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
המסלול subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום המתוארים כאן יש יתרונות ברורים על פני נתיבים אחרים של זיהום. היא מאפשרת החוקרים ללמוד את האינטראקציה החיידק המארח ו השפעת רכיבי חיידקי על תגובות חיסוניות מארח ישירות במוח, המחקות חיידקי הכניסה לתוך מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, ניתן להאריך את המסלול הז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מפתח הלאומי, תוכנית פיתוח של סין [2017YFD0500102]; הקרן הלאומית למדע הטבעי של סין [31572544]; המדינה מפתח המעבדה לביולוגיה Etiological וטרינרי [SKLVEB2016KFKT005]; החקלאות שנגחאי להחיל תוכנית פיתוח טכנולוגיה, סין [G2016060201].
Materials
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?. Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
