Внутричерепная Subarachnoidal маршрут инфекции для расследования роли Streptococcus suis биоплёнки в менингита в мышиной модели инфекции
Summary
Здесь мы описать маршрут внутричерепного subarachnoidal инфекции у мышей для изучения роли биопленки в Streptococcus suis менингита. Эта инфекция модель подходит также для изучения патогенеза других бактериальный менингит и эффективность новых препаратов против бактериального менингита.
Abstract
Streptococcus suis -это не только основных бактериальной патогена свиней во всем мире, но и возникающих зоонозные агента. В организме человека и свиньи менингит является основным проявлением инфекции S. suis . Модель подходит инфекции является важным инструментом для понимания механизмов заболеваний, вызванных патогенами. Для изучения патогенеза S. suis инфекции были разработаны несколько маршрутов инфекции у мышей. Однако внутрибрюшинного, интраназально и внутривенного маршруты инфекции не подходят для изучения роли S. suis поверхности компонентов в менингита непосредственно в мозг, например внеклеточная матрица от биопленки. Хотя intracisternal прививка была использована для S. suis инфекции, точные укола не были описаны. Здесь внутричерепной subarachnoidal маршрут инфекции был описан в мышиной модели для изучения роли биопленки в S. suis менингита. S. suis планктонных клетки или клетки состояние биопленки непосредственно вводили в субарахноидальное пространство мышей через инъекции расположен 3,5 мм ростральной от bregma. Гистопатологические анализ и увеличение выражение mRNA TLR2 и цитокины ткани мозга от мышей, вводится с биопленки состояние клетки четко S. suis биопленки играет окончательный ролей в S. suis менингита. Этот маршрут инфекции имеет очевидные преимущества над другими путями инфекции, позволяя изучение взаимодействия хост бактерии. Кроме того, он позволяет эффект бактериальных компонентов на хост иммунные реакции непосредственно в мозг, чтобы быть оценены и имитирует бактериальных вход в центральной нервной системе. Этот маршрут инфекции может быть продлено расследование механизмов менингита, вызванного другими бактериями. Кроме того она может также использоваться для проверки эффективности препаратов против бактериального менингита.
Introduction
Streptococcus suis (S. suis) является основных бактериальной патогена свиней во всем мире, вызывая тяжелые заболевания, включая менингит, пневмония, сепсис, эндокардит и артрит1. Это также возникающих зоонозные агент. До настоящего времени сообщалось, что девять серотипов может привести к инфекции в организме человека, в том числе серотипов, 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 и 312,3,4. В организме человека и свиньи менингит является одним из основных клинических признаков инфекции S. suis . Во Вьетнаме и Таиланде S. suis является главной причиной менингита в5взрослых. Микробные биоплёнки являются микроорганизмы, которые соответствуют друг другу и сосредоточены на интерфейс; они крайне важны для вирулентности бактерий, выживание в различных средах и антибиотикорезистентности5. Биоплёнки обычно окружены внеклеточного матрикса, который обычно содержит полисахариды, белков и ДНК6. Последний имеет возможность пребывания воспалительных реакций и цитокина производства7. Участвовать в стрептококков менингита в предыдущих исследованиях сообщалось биопленки. Биопленки способствует Streptococcus agalactiae менингита в модели рыбы тиляпии и биопленки обнаружено в тканях мозга и вокруг менингеальные поверхностей в естественных условиях путем внутрибрюшного прививка8. При менингите пневмококк находится в состоянии биопленки как и бактерии в таком состоянии биопленки были более эффективным в стимулировании менингита в мыши инфекции модель9. Кроме того, в нашем предыдущем исследовании, биопленки состояние, связанное с S. suis в мозг мыши способствует бактериальной вирулентности, выживание анализ10. Однако прямых доказательств участия биопленки в S. suis менингита требует дальнейшего расследования.
Животные модели S. suis инфекции были разработаны в мышей, используя внутрибрюшинного (и.п.)11, интраназально (и.н.)12, внутривенные (и.в.)13и маршруты intracisternal (i.c.) инфекции14, 15 , 16. Однако, и.п., и.н. и и.в. маршруты инфекции не подходят для изучения роли S. suis поверхности компонентов в менингита непосредственно в мозг. К ним относятся внеклеточная матрица от биопленки. Хотя i.c. прививка была использована для S. suis инфекции, точные укола не был описан в этих документах. В отличие от стереотаксического координаты инъекции для прививки внутричерепного subarachnoidal явно были описаны в предыдущем исследовании17. Это позволило легко признание прививка точки и более упрощенным экспериментальный протокол. Кроме того маршрут внутричерепного subarachnoidal инфекции имитирует бактериальных вход в центральной нервной системе из пазухи или среднего уха17и отношения между среднего уха и менингита, вызванного S. suis была продемонстрирована Мадсен et al18. Кроме того применяя внутричерепного subarachnoidal маршрут инфекции в мышей, мы продемонстрировали, что S. suis малых РНК rss04 способствует менингита в наших предыдущих исследования10.
В настоящем исследовании, внутричерепной subarachnoidal маршрут инфекции был использован в мышей для расследования роли биопленки в S. suis менингита. Мышей были инфицированы планктонных клетки или биопленки состояние клеток S. suis по этому маршруту инфекции. Гистопатологические анализ и увеличение выражение mRNA TLR2 и цитокинов из ткани мозга мышей, вводится с биопленки состояние клетки четко указывается, что S. suis биопленки способствует менингита.
Protocol
Representative Results
Discussion
Маршрут внутричерепного subarachnoidal инфекции, описанные здесь имеет очевидные преимущества над другими путями заражения. Это позволяет следователей для изучения взаимодействия хост бактерии и эффект бактериальных компонентов на хост иммунные реакции непосредственно в мозге, которые им…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана гранты национальных ключевых исследований и развития программа Китая [2017YFD0500102]; Национальный природный науки фонд Китая [31572544]; Государственный ключевой Лаборатория ветеринарной этиологические биологии [SKLVEB2016KFKT005]; в Шанхае сельского хозяйства применяется технология развития программы, Китай [G2016060201].
Materials
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?. Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
