Ruta de subaracnoideo intracraneal de la infección para investigar funciones de biopelículas del Streptococcus suis en Meningitis en un modelo murino de infección
Summary
Aquí, describimos la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección en ratones para estudiar el papel de los biofilms en Streptococcus suis meningitis. Este modelo de infección también es adecuado para el estudio de la patogenia de otra meningitis bacteriana y la eficacia de nuevos medicamentos contra la meningitis bacteriana.
Abstract
Streptococcus suis es no sólo un patógeno bacteriano importante de cerdos en todo el mundo, sino también un agente zoonótico emergente. En los seres humanos y cerdos, la meningitis es una manifestación importante de infecciones por S. suis . Un modelo adecuado de la infección es una herramienta esencial para comprender los mecanismos de las enfermedades causadas por patógenos. Varias rutas de la infección en ratones se han desarrollado para estudiar la patogenesia de la infección por S. suis . Sin embargo, las rutas de infección intraperitoneales, intranasales o intravenosas no son adecuadas para el estudio de las funciones de componentes superficiales de S. suis meningitis directamente en el cerebro, como la matriz extracelular de la biopelícula. Aunque la inoculación intracisternal se ha utilizado para la infección por S. suis , el sitio de inyección precisa no se ha descrito. Aquí, la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección fue descrita en un modelo de ratón para investigar el papel de biofilms en meningitis S. suis . Células planctónicas de S. suis o biofilm estado fueron inyectadas directamente en el espacio subaracnoideo de los ratones a través del sitio de inyección, situado a 3,5 mm rostral de la bregma. El análisis histopatológico y mayor expresión del ARNm de TLR2 y citoquinas del tejido cerebral de los ratones inyectados con las células del biofilm estado indican claramente que biofilm de S. suis juega un papel definitivo en meningitis S. suis . Esta ruta de infección tiene evidentes ventajas sobre otras vías de infección, permitiendo el estudio de la interacción de la bacteria huésped. Además, permite el efecto de componentes bacterianos en las respuestas inmunitarias de host directamente en el cerebro para ser evaluados y simula la entrada de bacteria en el sistema nervioso central. Esta ruta de infección se puede extender para investigar los mecanismos de la meningitis causada por otras bacterias. Además, también puede ser utilizado para probar la eficacia de los medicamentos contra la meningitis bacteriana.
Introduction
Streptococcus suis (S. suis) es un importante patógeno bacteriano de los cerdos en todo el mundo, causando enfermedades graves como meningitis, neumonía, septicemia, endocarditis y artritis1. También es un agente zoonótico emergente. Hasta ahora, se ha informado que nueve serotipos pueden causar infección en seres humanos, incluyendo los serotipos 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 y 312,3,4. En los seres humanos y cerdos, la meningitis es uno de los principales signos clínicos de infecciones por S. suis . En Vietnam y Tailandia, S. suis es la principal causa de meningitis en adultos5. Los biofilms microbianos son microorganismos que se adhieren entre sí y se concentra en una interfaz; son esenciales para la virulencia bacteriana, supervivencia en diversos ambientes y resistencia a los antibióticos5. Biofilms normalmente están rodeados por una matriz extracelular que generalmente contiene polisacáridos, proteínas y ADN6. Este último es capaz de provocar respuestas inflamatorias host y del cytokine producción7. Formación de biopelículas se ha divulgado en meningitis estreptocócica en estudios anteriores. Biofilms contribuyen a meningitis Streptococcus agalactiae en un modelo de pescado tilapia y formación de biopelículas se ha revelado dentro de los tejidos del cerebro y alrededor de meníngea superficies en vivo a través de inoculación intra abdominal8. Durante meningitis, estreptococo pneumoniae está en un estado similar al biofilm y bacterias en un biofilm estado fueron más efectivas en la inducción de meningitis en un modelo de infección del ratón9. Además, en nuestro anterior estudio, el estado de biofilm asociado con S. suis en cerebro de ratón contribuye a la virulencia bacteriana supervivencia análisis10. Sin embargo, la evidencia directa para la participación de biofilm de S. suis meningitis requiere más investigación.
Se han desarrollado modelos animales de infección por S. suis en ratones utilizando la intraperitoneal (i.p.)11, intranasal (i.n.)12, vía intravenosa (i.v.)13y las rutas intracisternal (i.c.) de infección14, 15 , 16. sin embargo, no son adecuadas para el estudio de las funciones de los componentes superficiales de S. suis en meningitis directamente en el cerebro las vías i.v., i.p. y i.n. de infección. Se trata de una matriz extracelular de la biopelícula. Aunque la inoculación de la i.c. se utilizó para la infección por S. suis , el sitio de inyección precisa no se ha descrito en estos documentos. En cambio, las coordenadas estereotáxicas del sitio de inyección para la inoculación intracraneal subaracnoidea se ha descrito claramente en un anterior estudio17. Esto permitió el fácil reconocimiento del punto de inoculación y más simplista protocolo experimental. Además, la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección mímico bacteriano entrada en sistema nervioso central de los senos paranasales o el oído medio17y la relación entre el oído medio y la meningitis causada por S. suis ha sido demostrado por Madsen et al18. Por otra parte, mediante la aplicación de la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección en ratones, hemos demostrado que S. suis pequeño RNA rss04 contribuye a la meningitis en nuestro anterior estudio10.
En el presente estudio, se utilizó la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección en ratones para investigar el papel de los biofilms en meningitis de los suis de S. . Infectaron a ratones con células planctónicas o células de estado de biofilm de S. suis por esta vía de infección. El análisis histopatológico y mayor expresión del ARNm de TLR2 y citoquinas del tejido cerebral de ratones inyectados con las células del biofilm estado indican claramente que el biofilm de S. suis contribuye a la meningitis.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ruta subaracnoidea intracraneal de la infección descrita aquí tiene evidentes ventajas sobre otras vías de infección. Permite a los investigadores a estudiar la interacción de la bacteria huésped y el efecto de componentes bacterianos en anfitrión inmunorespuestas directamente en el cerebro, que imitan la entrada bacteriana en el sistema nervioso central. Así, esta ruta de infección se puede extender para investigar los mecanismos de la meningitis causada por otras bacterias. Además, también puede ser utili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por becas de la investigación clave y programa de desarrollo de China [2017YFD0500102]; la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China [31572544]; el laboratorio estatal clave de Biología veterinaria etiológico [SKLVEB2016KFKT005]; la agricultura de Shanghai aplica programa de desarrollo de tecnología, China [G2016060201].
Materials
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?. Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
