Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti
Summary
Qui descriviamo un metodo per separare e arricchire i componenti del microambiente tumorale immuni e non immuni in tumori sottocutanei stabiliti. Questa tecnica permette l’analisi separata di tumore immuni si infiltra in e frazioni non immune tumore che possono consentire la caratterizzazione completa del microambiente tumorale immuni.
Abstract
Microambiente tumorale immuni (tempo) recentemente è stato riconosciuto come un mediatore critico di risposta al trattamento nei tumori solidi, soprattutto per le immunoterapie. Recenti progressi clinici nell’immunoterapia evidenziano l’esigenza di metodi riproducibili caratterizzare accuratamente e completamente il tumore e suoi associati si infiltrano in immuni. Digestione enzimatica del tumore e l’analisi cytometric di flusso permettono ampia caratterizzazione di numerosi sottoinsiemi delle cellule immuni e fenotipi; Tuttavia, profondità di analisi è spesso limitata dalla fluoroforo restrizioni sul design del pannello e la necessità di acquisire campioni di grande tumore di osservare rari popolazioni immuni di interesse. Così, abbiamo sviluppato un metodo efficace e ad alta produttività per la separazione e arricchendo l’infiltrato immune tumore dai componenti del tumore non immune. La digestione di tumore descritto e separazione centrifuga basati su densità tecnica permette separato caratterizzazione del tumore e tumore immuni si infiltra in frazioni e preserva la vitalità cellulare e quindi, fornisce un’ampia caratterizzazione del tumore stato immunologico. Questo metodo è stato usato per caratterizzare la vasta eterogeneità immuni spaziale nei tumori solidi, che dimostra ulteriormente la necessità di tecniche di analisi immunologiche coerente intero tumore. Nel complesso, questo metodo fornisce una tecnica efficace ed adattabile per la caratterizzazione immunologica dei tumori murini solidi sottocutanei; come tale, questo strumento può essere utilizzato per caratterizzare meglio le caratteristiche immunologiche tumorale e nella valutazione preclinica di nuove strategie immunoterapeutiche.
Introduction
Il tempo soppressivo recentemente è stato riconosciuto come un marchio di garanzia di cancro ed è conosciuto per svolgere un ruolo significativo nello sviluppo, progressione e nella protezione dei cancri solidi del tumore così come mitigare la loro suscettibilità all’immunoterapia1. Il tempo è composto di numerosi cellulari sottoinsiemi e fenotipi, che forniscono approfondimenti critici dello stato immunologico del tumore. Questi sottoinsiemi immunologici possono essere ulteriormente stratificati nelle cellule del linfocita o origine mieloide, che insieme costituiscono la maggior parte della risposta immunitaria innata e adattativa2,3. I recenti progressi nel campo dell’immunoterapia del cancro hanno dimostrato che strategie di immunoterapia (cioè, gli inibitori di checkpoint immuni, recettore chimerico antigene T-cellule, ecc.) hanno il potenziale di indurre cancro durevole regressioni; Tuttavia, rimangono relativamente inefficace nel tumore solido cancri4,5. Numerosi gruppi hanno mostrato la transenna critica che il tempo può svolgere il trattamento successo6,7, e così, ci rimane la necessità di valutare con precisione le nuove immunoterapie in ambito pre-clinico, occupandosi in particolare del loro capacità di modulare o superare il tempo8.
Gli sforzi attuali per caratterizzare il tempo in genere utilizzano entrambi microscopia o flusso cytometry insieme strategie per identificare immuni cellulari sottoinsiemi e loro caratteristiche9,10di contrassegno dell’anticorpo. Queste due strategie forniscono informazioni in modo univoco diverse, come la microscopia permette spaziale apprezzamento dei sottoinsiemi cellulare e citometria a flusso fornisce throughput elevato e più ampia quantificazione dei cambiamenti cellulari. Nonostante i recenti miglioramenti in immunoistochimica multisala fluorescente l’ottimizzazione di sistemi di imaging spettrale, che ora possono supportare fino a 7 parametri, dimensioni pannello limitato rendono vasto livello immunitario profilatura difficile e così questa tecnica è spesso riservati per più concentrata di analisi. Di conseguenza, citometria a flusso rimane uno del sistema immunitario più ampiamente usato tecniche di profilatura. Nonostante il suo uso diffuso nella caratterizzazione di tempo, i metodi utilizzati per la lavorazione e colorazione sono molto variabili. Più spesso protocolli utilizzano un tumore dissociando enzima (cioè, collagenasi, DNasi, ecc.) e metodi di dissociazione manuale per raggiungere sospensioni unicellulari, seguita da anticorpo che macchia e analisi7. Nonostante i vantaggi di ciascun metodo, numerosi gruppi hanno dimostrato la notevole variabilità che può essere indotta attraverso queste tecniche11. Questo rende la croce-Studio comparazioni di profilatura di microambiente del tumore estremamente difficile, anche quando valutare lo stesso modello di tumore murino. Inoltre, questi metodi forniscono un potenziale limitato per valutare il tumore cellulare e immunitaria tumore infiltrarsi componenti in modo indipendente, dal momento che entrambi i componenti sono sparpagliati dopo la digestione. Quantità di campione limita quindi multi-pannello di colorazione e di analisi, che diventa un grosso problema durante il tentativo di caratterizzare sottoinsiemi immunologiche rare (cioè, tumore-specifiche cellule T)12. Tecniche più recenti come massa cytometry, o citometria a tempo di volo (CyTOF), permettono di alto-dimensionali analisi fenotipica di sottopopolazioni cellulari con alcuni sistemi di supporto disegni pannello superiore a 42 parametri indipendenti13. Nonostante l’enorme potenza di tecnologia CyTOF in profilatura immuni, resta limitato a causa di spese, competenze di analisi e l’accesso all’apparecchiatura. Inoltre, molti protocolli di CyTOF consiglia di purificazione dei sottoinsiemi immuni per migliorare i rapporti segnale-rumore14, e quindi suggeriamo che il nostro metodo di arricchimento poteva essere utilizzato a monte dell’analisi CyTOF per migliorare la qualità dei dati.
Qui descriviamo una digestione microambiente del tumore e analisi metodo che incorpora immunitaria tumore infiltrarsi separazione. Lo scopo di questo metodo è quello di consentire indipendente high throughput profilatura del si infiltra in sistema immunitario in tumore e frazioni cellulari del tumore per la più ampia caratterizzazione del microambiente tumorale. Utilizzando questo metodo, noi dimostrare ulteriormente l’importanza di eseguire analisi di intero tumore, come un modello di tumore solido sottocutaneo è stato trovato per avere significativa eterogeneità spaziale immunologica. Nel complesso, questo metodo può più accuratamente e costantemente confrontare tra campioni perché arricchisce per sottoinsiemi immuni cellulari all’interno del tumore e permette per la profilatura indipendente delle cellule del tumore e frazioni immunitarie di un tumore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il tempo è composto di molecole e componenti cellulari diversi e complessi. La prova recente suggerisce che accurata caratterizzazione di questo ambiente in grado di fornire una migliore comprensione del trattamento esito positivo o negativo e può anche aiutare a identificare i meccanismi di resistenza terapeutica. Ad esempio, aumentando i livelli di intratumoral di varie cellule immunosoppressive (cioè, MDSC, cellule T regolatorie, ecc.) possa attenuare le risposte immunitarie effettrici ed abrogare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN riconosce sostegno finanziario dal National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) e dal National Institute of Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) entrambi i National Institutes of Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Questo progetto è stato supportato anche dalla citometria e nucleo di ordinamento delle cellule presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti dal NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 e S10 RR024574) e l’assistenza di esperti di Joel M. Sederstrom.
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
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