Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zum Trennen und Bestandteil der Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebung in etablierte subkutane Tumoren zu bereichern. Diese Technik ermöglicht die separate Analyse der Tumor immun infiltrieren und nicht-immunen Tumor Fraktionen die umfassende Charakterisierung der Tumor immun Mikroumgebung ermöglichen können.
Abstract
Der Tumor immun Mikroumgebung (Zeit) wurde vor kurzem als kritischer Vermittler der Behandlungserfolg bei soliden Tumoren, vor allem für Immuntherapien anerkannt. Jüngste klinische Fortschritte in der Immuntherapie unterstreichen die Notwendigkeit für reproduzierbare Methoden genau und gründlich den Tumor und seine damit verbundenen immun infiltrieren zu charakterisieren. Tumor enzymatischen Verdauung und durchflusszytometrischen Analyse ermöglichen umfassende Charakterisierung von zahlreichen Immunzelle Teilmengen und Phänotypen; Tiefe der Analyse wird jedoch oft durch Fluorophor Beschränkungen der Panel-Design und die Notwendigkeit, große tumorproben erwerben seltene immun Populationen von Interesse zu beobachten begrenzt. So haben wir eine effektive und hohe Durchsatz-Methode zum Trennen und bereichern das Tumor immun Infiltrat aus den nicht-immunen Tumor-Komponenten entwickelt. Die beschriebenen Tumor Verdauung und zentrifugale Dichte basierenden Trennung Technik ermöglicht separate Charakterisierung des Tumors und Tumor immun Infiltrat Brüche und zelluläre Rentabilität bewahrt und stellt somit eine umfassende Charakterisierung des Tumors immunologischen Status. Diese Methode wurde verwendet, um die umfangreichen räumlichen immun Heterogenität in soliden Tumoren, charakterisieren die weiterer Beweis für die Notwendigkeit einer einheitlichen ganzen Tumor immunologischen profiling Techniken. Insgesamt bietet diese Methode eine wirksame und anpassungsfähige Technik für die immunologische Charakterisierung von subkutanen soliden murinen Tumoren; So kann dieses Tool verwendet werden, um den Tumor immunologischen Funktionen besser zu charakterisieren und in die präklinische Bewertung der neuartigen immunotherapeutic Strategien.
Introduction
Die unterdrückende Zeit ist vor kurzem als ein Markenzeichen von Krebs erkannt worden und bekannt, um eine bedeutende Rolle in der Entwicklung, Fortschritt und Schutz der soliden Tumoren Krebserkrankungen sowie ihre Anfälligkeit für Immuntherapie1zu mildern. Die Zeit besteht aus zahlreichen zellulären Teilmengen und Phänotypen, die kritischen Einblick in den immunologischen Status des Tumors liefern. Diese immunologischen Teilmengen können weiter in Zellen Lymphozyten oder myeloischen Ursprungs geschichtet werden, bilden zusammen die Mehrheit der angeborenen und der adaptiven Immunantwort2,3. Die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der Krebsimmuntherapie haben gezeigt, dass immunotherapeutic Strategien (z.B. immun Checkpoint-Inhibitoren, chimeric Antigen Rezeptor T-Zellen, etc.) das Potenzial haben, dauerhafte Krebs auslösen Regressionen; Sie bleiben jedoch relativ unwirksam bei soliden Tumoren Krebserkrankungen4,5. Zahlreiche Gruppen haben der kritische Hürde gezeigt, dass die Zeit am Behandlung Erfolg6,7spielen kann, und somit müssen genau bewertet werden neue Immuntherapien in der präklinischen Einstellung mit Schwerpunkt speziell bleibt auf ihre Fähigkeit, zu modulieren oder zu überwinden, die Zeit8.
Aktuellen Bemühungen um die Zeit in der Regel charakterisieren nutzen entweder Mikroskopie oder flow Cytometry zusammen mit Antikörper labeling Strategien zur Ermittlung immun zellulären Teilmengen und ihre Funktionen9,10. Diese beiden Strategien informieren einzigartig anders, wie Mikroskopie räumliche Aufwertung des zellulären Teilmengen ermöglicht und Durchflusszytometrie hohen Durchsatz und breiteren Quantifizierung der Zellveränderungen bietet. Trotz der jüngsten Verbesserungen in fluoreszierenden multiplex Immunohistochemistry Optimierung spectral imaging Systeme, die nun bis zu 7 Parameter unterstützen können, begrenzt Panelgröße erschwert breiten Ebene immun Profilierung und somit ist diese Technik oft reserviert für weitere Analysen konzentriert. Infolgedessen bleibt Durchflusszytometrie eines der am weitesten verbreitete Immune profiling Techniken. Trotz seiner weiten Verbreitung in Zeit Charakterisierung sind die Methoden zur Verarbeitung und Färbung sehr variabel. Am häufigsten Protokolle nutzen ein Tumors abkoppelt Enzym (d. h. Collagenases, DNase, etc.) und manuelle Dissoziation Methoden, einzellige Suspensionen zu erreichen, gefolgt von Antikörper Färbung und Analyse7. Trotz der Vorteile der einzelnen Methoden haben zahlreiche Gruppen die umfangreiche Variabilität gezeigt, die durch diese Techniken11induziert werden kann. Dadurch Kreuz-Studie Vergleiche des Tumors Mikroumgebung profiling extrem schwierig, selbst wenn das gleiche Modell murine Tumor zu bewerten. Darüber hinaus diese Methoden bieten begrenzten Potential, Tumor zellulären bewerten und Tumor-Immunantwort zu infiltrieren Komponenten unabhängig voneinander, da beide Komponenten nach der Verdauung durchsetzt sind. Probenmenge begrenzt dann Multi-Panel zu beflecken und Analyse, die ein wichtiges Thema wird bei dem Versuch, seltene immunologische Teilmengen zu charakterisieren (z.B. Tumor-spezifischen T-Zellen)12. Neuere Techniken wie Masse zytometrie oder Cytometry durch Flugzeit (CyTOF), ermöglichen hochdimensionalen phänotypische Analyse der zellulären Teilmengen mit einigen Systemen Panel Entwürfe von mehr als 42 unabhängige Parameter13zu unterstützen. Trotz der enormen Kraft CyTOF Technologie in immun-profiling bleibt es wegen der Kosten, Analyse-Kompetenz und der Zugang zu den Geräten begrenzt. Darüber hinaus viele CyTOF Protokolle empfehlen Reinigung immun Teilmengen, Signal-Rausch-Verhältnis14zu verbessern, und so empfehlen wir, dass unsere Bereicherung-Methode verwendet werden könnte oberhalb der CyTOF Analyse zur Verbesserung der Datenqualität.
Hier beschreiben wir eine Tumor Mikroumgebung Verdauung und Analyse-Methode, die Tumor-Immunantwort enthält infiltrieren Trennung. Diese Methode soll ermöglichen, unabhängige Hochdurchsatz-Profilierung der Tumor immun infiltrieren und Tumor zellulären Fraktionen zur weiteren Charakterisierung von Tumor Mikroumgebung. Mit dieser Methode zeigen wir weiter die Bedeutung der ganze Tumor Analyse, wie eine subkutane soliden Tumoren Modell gefunden wurde, um erhebliche räumliche immunologischen Heterogenität zu haben. Insgesamt kann diese Methode genauer und konsequent zwischen Proben vergleichen, weil es für immun zellulären Teilmengen im Tumor bereichert und ermöglicht unabhängige Profilierung der Tumorzelle und immun Bruchteile eines Tumors.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zur Zeit besteht aus vielfältigen und komplexen zellulären Komponenten und Moleküle. Aktuelle Hinweise darauf, dass genaue Charakterisierung dieser Umgebung bieten ein besseres Verständnis der Behandlungserfolg oder Misserfolg, und sogar helfen kann, Mechanismen der therapeutischen Widerstand zu identifizieren. Intratumorale Anhebung der verschiedenen immunsuppressiven Zellen (d. h. MDSCs, regulatorische T-Zellen, etc.) kann beispielsweise Effektor Immunantworten zu mildern und immuntherapeutischen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN erkennt finanziellen Unterstützung vom National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) und dem nationalen Institut der Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) sowohl von den National Institutes of Health. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. Dieses Projekt wurde auch durch die Zytometrie und Zellkern Sortierung am Baylor College of Medicine unterstützt mit Mitteln aus dem NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 und S10 RR024574) und die Unterstützung durch Experten der Joel M. Sederstrom.
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
