Beurteilung der Lebensfähigkeit eines synthetischen bakterielle Konsortiums auf der In-vitro- Darm Host-Mikrobe Oberfläche
Summary
Darm-Host-Mikroben-Interaktionen wurden bewertet, mit einem neuartigen Ansatz kombiniert eine synthetische mündliche Gemeinschaft, in-vitro- Magen-Darm-Verdauung und ein Modell der Dünndarm Epithel. Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die auszuwertende ZELLINVASION von Krankheitserregern und Multi-Spezies-Biofilmen oder sogar probiotischen Formulierungen Überlebensfähigkeit getestet angepasst werden kann.
Abstract
Das Zusammenspiel zwischen Host und Mikrobiota wurde längst erkannt und ausführlich beschrieben. Der Mund ist ähnlich wie bei anderen Abschnitten des Magen-Darm-Trakt, wie resident Mikrobiota auftritt und Kolonisierung durch exogene Bakterien verhindert. In der Tat mehr als 600 Arten von Bakterien in der Mundhöhle gefunden werden, und ein einzelnes Individuum kann rund 100 verschiedene jederzeit tragen. Orale Bakterien besitzen die Fähigkeit zur Einhaltung der verschiedenen Nischen im mündlichen Ökosystem, also innerhalb der ansässigen mikrobieller Gemeinschaften und Begünstigung Wachstum und Überleben integriert. Jedoch wurde die Strömung von Bakterien in den Darm beim Schlucken stören das Gleichgewicht der Darm Microbiota vorgeschlagen. In der Tat verschoben oraler Verabreichung von p. Gingivalis bakterielle Zusammensetzung im Ileum Mikroflora. Wir nutzten eine synthetische Gemeinschaft als eine vereinfachte Darstellung des natürlichen Ökosystems mündliche, das Überleben und die Lebensfähigkeit der mundbakterien simulierten Magen-Darm-Transit Bedingungen unterworfen aufzuklären. Vierzehn Arten wurden ausgewählt, in-vitro- Speichel, Magen und Darm Verdauungsprozesse ausgesetzt und präsentiert eine multicompartment Zellmodell Caco-2 und HT29-MTX Zellen um die Darm-Schleimhaut-Epithel zu simulieren. Dieses Modell diente dazu, die Auswirkungen der schluckte Bakterien auf Zellen in den enterohepatischen Kreislauf zu entwirren. Mit synthetischen Gemeinschaften können Kontrollierbarkeit und Reproduzierbarkeit. So, diese Methodik lässt sich anpassen, Erreger Lebensfähigkeit und nachträgliche Entzündung verbundenen Änderungen, Kolonisation Kapazität von probiotischen Mischungen zu beurteilen und letztlich mögliche bakterielle Auswirkungenauf den presystemic Kreislauf.
Introduction
Menschen Zusammenleben mit Bakterien, die unter der gleichen Nummer wie menschliche Zellen1vorhanden sind. Daher ist es von entscheidender Bedeutung wichtig, ein umfassendes Verständnis für die menschlichen Mikrobiom zu erhalten. Die Mundhöhle ist ein einzigartiges Umfeld, dass mehrere kleinere Lebensräume unterteilt ist, so enthält eine Vielzahl von Bakterien und Biofilme an den verschiedenen Standorten. Ein offenes Ökosystem können, einige Arten im Mund vorübergehende Besucher sein. Bestimmte Mikroorganismen besiedeln jedoch bald nach der Geburt und bilden Biofilme2organisiert. Diese sind in der Zahnoberfläche oberhalb der Gingiva Spalt, der subgingivalen Spalt, Zunge, Schleimhaut-Oberflächen und zahnärztliche Prothetik und Füllungen3gefunden. Bakterien können auch vorhanden sein, wie Flocken und planktischen Zellen in das Lumen des Zahn-Kanals, vermischt mit nekrotischen Pulpagewebe oder in einer flüssigen Phase ausgesetzt.
Es gibt aktive und kontinuierliche Übersprechen zwischen Wirtszellen und die ansässigen Mikrobiota-4. Bakterien kommunizieren innerhalb und zwischen den Arten, und nur ein kleiner Teil der natürlichen Kolonisatoren kann Gewebe, einhalten, während andere Bakterien, diese primäre Kolonisatoren befestigen. Zum Beispiel ist Zell-Zell-Bindung zwischen Mikroorganismen Schlüssel für sekundäre Kolonisatoren in orale Biofilme zu integrieren, und den Aufbau komplexer Netzwerke interagierender mikrobiellen Zellen4. Rund werden 70 % der bakteriellen Aggregate in eine Speichelprobe durch Bakterien SP., Streptococcus SP., Prevotella SP., Veillonella SP. und nicht identifizierten Bacteroidetesgebildet. F. Nucleatum ist ein Zwischenprodukt Kolonisator im subgingivaler Biofilm und Aggregate mit den späten Kolonisatoren p. Gingivalis, T. Denticola und Forsythia Forsythien, die an Parodontitis5beteiligt sind. Darüber hinaus nimmt Streptococcus Mitis Schleimhaut- und dental Lebensräume, während S. Sanguinis und S. Gordonii bevorzugen, Zähne3zu kolonisieren. Somit ist, S. Sanguinis in unteren Schneidezähne und Eckzähne, während im oberen Frontzähne6 Actinomyces Naeslundii gefunden wurde.
Darüber hinaus spielt die indigenen Microbiome eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit2. Resident Mikrobiota beteiligt sich an immun Bildung und Ausbau der Erreger zu verhindern. Diese Kolonisierung Widerstand tritt auf, weil die native Bakterien besser angepasst an Oberflächen anbringen und effizienter Energiestoffwechsel die verfügbaren Nährstoffe für das Wachstum sein können. Obwohl probiotische Stämme die Magen-Darm-Passage überleben und aktiv bleiben, wurde das Fortbestehen der autochthonen Bakterien verschluckt von einer oberen Lage des Magen-Darm-Trakt nicht vollständig beschrieben. Damit unterworfen wir eine künstliche Community, Vertreter des Ökosystems mündliche simulierten Magen-Darm-Transit Bedingungen. Lebensfähigkeit der Bakterienzellen wurde anhand eines multicompartment Modells ähnelt das Darm Epithel. Aktuelle Darm Simulatoren bieten geeignete Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Analyse der luminalen mikrobiellen Gemeinschaft7. Allerdings sind bakterielle Adhäsion und Host-Mikroben-Interaktion gesondert behandelt, als Kombination von Zelllinien mit mikrobieller Gemeinschaften8herausfordert. Im Gegensatz dazu präsentieren wir Ihnen einen Rahmen, der potenzielle mechanistische Erklärung der erfolgreichen Kolonisation Ereignisse berichtete über die Darm-Schnittstelle bietet. Dieses Modell kann in der Tat gemeinsam mit einem statischen Darm-Modell zur Bewertung der Auswirkungen von mikrobiellen Gemeinschaften auf Host Oberfläche Signalisierung verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die mündliche Microbiome ist ein zentrales Element in der menschlichen Gesundheit, wie kürzlich berichtet von mehreren Autoren20,21. Bisherigen Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Einnahme von Speichel, die große Belastungen des Bakteriums enthalten die mikrobiellen Ökosystems des Dünndarms, beeinflussen kann, ist einer der wichtigsten Standorte für immune Priming. Die Kombination eines statischen oberen Magen-Darm-Verdauung-Modells mit der Host-Schnit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen dankbar finanziellen Unterstützung von Flandern Research Foundation, Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral Fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria ist postdoctoral Fellow von Flandern Innovation und Unternehmertum (Agentschap Voor Innovatie Tür vielen de Technologie, Binnenschifffahrt) unterstützt.
Materials
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | – | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | – | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
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