Ex Vivo Кальция изображений для визуализации мозга ответы на эндокринных сигнализации в дрозофилы
Summary
Этот документ описывает протокол для ex vivo кальция томография головного мозга дрозофилы . В этом методе натуральных или синтетических соединений может применяться в буфер, чтобы проверить свои способности для активации определенной нейронов в головном мозге.
Abstract
Орган орган связи, эндокринных сигнализации, например, от периферии к мозгу, имеет важное значение для поддержания гомеостаза. Как животное модель эндокринных исследований, Drosophila melanogaster, который сложных генетических инструменты и информацию геном, все чаще используется. Эта статья описывает метод для кальция томографии мозга эксплантов дрозофилы . Этот метод позволяет выявлять прямой сигнализации гормона в мозг. Хорошо известно, что многие пептидные гормоны действуют через G-белок-рецепторы (GPCR), чьи Активация приводит к увеличению концентрации внутриклеточного Ca2 +. Нейронные активации также повышает внутриклеточное Ca2 + уровней, от Ca2 + приток и выхода Ca2 + хранятся в эндоплазматический ретикулум (ER). Датчиком кальция, GCaMP, можно контролировать эти Ca2 + изменения. В этом методе, GCaMP выражается в нейронах интерес, и выражая GCaMP личинок мозг расчлененные и культивировали ex vivo. Пептид тест затем применяется к экспланта мозга, и флуоресцентные изменения в GCaMP обнаруживаются с помощью вращающийся диск Конфокальный микроскоп оснащены ПЗС-камеры. С помощью этого метода, может быть проверена любая молекула, растворимый в воде, и различных клеточных события, связанные с нервной активации может отражаться с использованием соответствующих показателей флуоресцентные. Кроме того изменяя тепловизионной камеры, этот метод может использоваться для изображения другие Drosophila органов или органов других животных.
Introduction
Орган орган коммуникация является эволюционно сохранены стратегия для поддержания гомеостаза справляться с экологическими изменениями. В организме человека, различные гормоны arereleased от эндокринных желез в кровоток. Многие из этих гормонов целевой гипоталамусе мозга, который регулирует метаболические процессы и основных поведения, таких как кормления1,2. Многие гормоны были обнаружены с помощью млекопитающих моделей. Однако механизмы их действия, особенно межорганных сетей, в которых они участвуют, остаются во многом неясными.
Drosophila melanogaster стала полезной моделью для изучения орган орган коммуникации. У насекомых многие физиологические процессы находятся под контролем гормонов. Ранние исследования, сосредоточив внимание на рост и метаморфозы используется крупными насекомыми. В этих исследованиях удаления или трансплантации органов конкретных предсказал существование межучрежденческого органа сигнальных молекул; позже биохимически очищенных3,,45были несовершеннолетних гормонов (JH), Prothoracicotropic гормон (Переднегрудь) и экдистероидов. Считается, что большое семейство межклеточной сигнализации пептидов быть вовлечены в различных физиологических событий во время жизненного цикла насекомых6,7. Большинство из этих пептидов действуют на G-белок-рецепторы (GPCR), хотя конкретные GPCR были изначально трудно идентифицировать с помощью традиционных подходов. Публикация на весь геном дрозофилы последовательности8 был прорыв, который позволил идентификации дрозофилы биоактивные пептиды, основанный на их гомологии для тех, кто в других насекомых. Кроме того были определены рецепторов для нескольких пептидов из GPCR, предсказал в геноме используя основанные на клетки культура GPCR-лиганд привязки анализов. Далее выражение анализы предсказал пути орган орган, вызвало эти пептиды и рецепторы. Примечательно многие из предполагаемых пептид рецепторов выражаются в головном мозге, предполагая, что мозг является одной из основных целей пептидных гормонов9. Кроме того дополнительные генетические инструменты в дрозофилы способствовали идентификации физиологической роли пептид ХВГФ комбинаций. Например GAL4 и двоичные транскрипционный анализ систем, основанных на LexA позволяют нокдаун гена или гиперэкспрессия пространственно и височно контролируемым образом. GAL4, транскрипционный фактор, выявленных в дрожжи, привязывается к определенной СНГ регуляторные последовательности называется вверх по течению последовательности активации (бас). В системе GAL4/Уан водитель линия обеспечивает ткани конкретных или стадии конкретных GAL4 выражения и линии ответчик несет UAS вверх по течению гена интереса или конструкцию привода индуцируемый выражение. LexA/LexAop система основана на аналогичный механизм. Фенотипические анализы ткани конкретных пептид нокдаун и ткани конкретных GPCR-нокдаун животных может раскрыть информацию о режиме сигнальный пептид GPCR и сайт действий. Однако выводы, которые могут быть достигнуты лишь путем генетических данных ограничены. С другой стороны после предполагаемого целевой конкретной пептидный гормон сужано вниз к типу ткани или клетки, ex vivo кальция изображений в орган эксплантов может использоваться для уточнения связи орган орган, при посредничестве сигнальный пептид GPCR. После активации Gq в сочетании GPCR внутриклеточный Ca2 + концентрация увеличивается из-за выхода Ca2 + ER10. В головном мозге нейронные активации также поднимает внутриклеточных Ca2 + уровнях. Такое Ca2 + увеличение могут быть обнаружены датчиком кальция, GCaMP, который претерпевает конформационные изменения в присутствии Ca2 + результате флуоресценции выбросов11.
В этой статье описан кальция, которые эксплантах изображений методом дрозофилы мозга. Для проверки способности пептидной активировать определенных нейронов, пептид тест применяется к экспланта мозга выразив GCaMP, и флуоресценции изменения контролируются confocal микроскопии. Участие GPCR затем подтвердил, выполнив же анализа с использованием мутантов мозга отсутствует GPCR. Эта комбинация изображений и генетики предоставляет точную информацию о связи орган орган, пептиды-обсуждаются также GPCR. возможные изменения и применение настоящего Протокола.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ca2 + изображения метод, описанный здесь является полезной системы для тестирования функции гормонов в головном мозге. В естественных условиях, мозг получает гормонов из различных эндокринных органов. Кроме того мозг воспринимает постоянно, по возрастанию сенсорной информац?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана дотаций для научных исследований (15K 07147, 17K 07419) из страниц JSP (Hiroshi Исимото, Хироко Sano), Фонд исследовательский грант Инамори (для HI) и программа совместного использования/исследовательский центр для развития медицины, на Институт молекулярной эмбриологии и генетики, Университет Кумамото (для HS). Мы благодарим д-р Азуза Kamikouchi и г-н Ямада Daichi за их помощь в использовании система электронного фотографирования.
Materials
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
References
- Morton, G. J., Schwartz, M. W. Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism. Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).
- Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. Hormonal regulation of food intake. Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).
- Goodman, W. G., Cusson, M., Gilbert, L. I. The juvenile hormones. Insect Endocrinology. , 310-365 (2012).
- Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H., Gilbert, L. I. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. Insect Endocrinology. , 106-176 (2012).
- Smith, W., Rybczynski, R., Gilbert, L. I. Protothoracicotropic hormone. Insect Endocrinology. , 1-62 (2012).
- Claeys, I., et al. Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions. Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).
- Gade, G., Goldsworthy, G. J. Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control. Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in. PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila. Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).
- Sano, H., et al. The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster. PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Sabado, V. a. N., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).
- Apostolopoulou, A. A., et al. Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).
- Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
