Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Summary

Dit witboek beschrijft een protocol voor ex vivo calcium beeldvorming van de hersenen van Drosophila . Bij deze methode, kunnen natuurlijke of synthetische verbindingen worden toegepast op de buffer voor het testen van hun vermogen om bepaalde neuronen in de hersenen activeren.

Abstract

Orgel-naar-orgel communicatie door endocriene signalering, bijvoorbeeld is vanuit de periferie naar de hersenen, essentieel voor het behoud van homeostase. Als een dier model voor endocriene onderzoek, wordt Drosophila melanogaster, die heeft verfijnde genetische hulpmiddelen en genoominformatie, steeds meer ingezet. Dit artikel beschrijft een methode voor de calcium-beeldvorming van Drosophila hersenen explantaten. Deze methode kan de detectie van de directe signalering van een hormoon aan de hersenen. Het is algemeen bekend dat vele peptide hormonen via de G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCRs) handelen, wiens activering een verhoging van de intracellulaire Ca^{2 +}concentratie veroorzaakt. Neurale activering verheft ook intracellulaire Ca^{2 +} niveaus, variërend van zowel Ca^{2 +} toestroom en de vrijlating van Ca^{2 +} opgeslagen in het endoplasmatisch reticulum (ER). Een calcium-sensor, GCaMP, kan deze Ca^{2 +} wijzigingen controleren. Bij deze methode GCaMP wordt uitgedrukt in de neuronen van belang, en de GCaMP-uiten larvale hersenen is ontleed en gekweekte ex vivo. De test-peptide wordt vervolgens toegepast op de hersenen explant, en de fluorescerende wijzigingen in GCaMP worden gedetecteerd met behulp van een draaiende schijf confocal microscoop uitgerust met een CCD-camera. Met behulp van deze methode, een in water oplosbare molecuul kan worden getest, en verschillende cellulaire gebeurtenissen die zijn gekoppeld aan de neurale activering kunnen worden beeld met behulp van de passende fluorescerende indicatoren. Bovendien, door aanpassing van de beeldvorming kamer, deze methode kan worden gebruikt om het imago van de organen van andere Drosophila of de organen van andere dieren.

Introduction

Mededeling van de orgel-naar-orgel is een evolutionair geconserveerde strategie voor het behoud van de homeostase om te gaan met veranderingen in het milieu. Bij de mens, een scala aan hormonen arereleased van de endocriene klieren in de circulatie. Veel van deze hormonen richten de hypothalamus van de hersenen, die regelt metabole processen en fundamentele gedrag zoals het voederen van^1,2. Veel hormonen hebben ontdekt met behulp van zoogdieren modellen. Nochtans, de mechanismen van hun optreden, met name de interorgan netwerken waaraan zij deelnemen, grotendeels onduidelijk blijven.

Drosophila melanogaster heeft ontpopt als een nuttig model voor het bestuderen van de mededeling van de orgel-naar-orgel. Bij insecten, worden veel fysiologische processen gecontroleerd door hormonen. Vroege studies gericht op groei en metamorfose gebruikt grote insecten. In deze studies voorspelde de verwijdering of transplantatie van specifieke organen het bestaan van Inter orgel signalering moleculen; later, waren Juvenile hormoon (JH), Prothoracicotropic hormoon (PTTH) en Ecdysone biochemically gezuiverde^3,4,5. Een grote familie van intercellulaire signalering peptiden wordt gedacht te worden betrokken bij diverse fysiologische evenementen tijdens de levenscyclus van de insecten^6,7. De meeste van deze peptides handelen op de G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCRs), hoewel de specifieke GPCRs in eerste instantie moeilijk waren te identificeren met behulp van conventionele benaderingen. De publicatie van de Drosophila hele genoom reeks⁸ was de doorbraak die de identificatie van Drosophila bioactieve peptiden op basis van hun homologie met die gevonden in andere insecten ingeschakeld. Daarnaast werden de receptoren voor verschillende peptides geïdentificeerd van GPCRs voorspeld in het genoom met behulp van cel-cultuur-gebaseerde GPCR-ligand bindende analyses. Vervolgens voorspelde expressie analyses de orgel-naar-orgel trajecten ontlokte door deze peptiden en de receptoren. Met name worden veel van de vermeende peptide receptoren uitgedrukt in de hersenen, wat suggereert dat de hersenen een belangrijk doelwit van peptide hormonen^{9 is}. Bovendien hebben de geavanceerde genetische hulpmiddelen in Drosophila bijgedragen tot de identificatie van fysiologische functies van peptide-GPCR combinaties. Bijvoorbeeld, inschakelen de GAL4 en de LexA gebaseerde binaire transcriptionele systemen gene knockdown of overexpressie in een ruimtelijk en tijd gecontroleerde manier. GAL4, een transcriptiefactor geïdentificeerd in gist, bindt aan een specifieke cis-regulerende opeenvolging Upstream activering sequentie (UAS) genoemd. In de GAL4/UAS-systeem, de driver regel biedt weefsel-specifieke of expressie van fase-specifieke GAL4 en de responder-lijn draagt UAS stroomopwaarts van het gen van belang of de constructie op station shRNA expressie. LexA/LexAop systeem is gebaseerd op een soortgelijk mechanisme. Fenotypische analyse van weefsel-specifieke peptide-knockdown en weefsel-specifieke GPCR-knockdown dieren kunnen onthullen informatie over de peptide-GPCR signalering modus en werkplek waar de activiteiten. De conclusies die bereikbaar uitsluitend per genetische gegevens zijn echter beperkt. Aan de andere kant, zodra het vermeende doelwit van een bepaalde peptide hormonen is teruggebracht tot een type weefsels of cellen, kan ex vivo calcium beeldvorming in orgel explantaten worden gebruikt voor het ophelderen van de mededeling van de orgel-naar-orgel gemedieerd door peptide-GPCR signalering. Bij het activeren van een GPCR Gq-combinatie, wordt de intracellulaire Ca^{2 +} concentratie verhoogd door de vrijval van Ca^{2 +} van de ER¹⁰. In de hersenen verheft de neurale activering ook de intracellulaire Ca^{2 +} niveaus. Dergelijke Ca^{2 +} verhogingen kunnen worden gedetecteerd door een calcium-sensor, GCaMP, die conformationele veranderingen in aanwezigheid van Ca^{2 +} resulterend in fluorescentie emissie¹¹ondergaat.

In dit artikel wordt een calcium beeldvorming methode met behulp van Drosophila hersenen explants beschreven. Om te testen op het vermogen van een peptide te activeren van specifieke neuronen, een test-peptide wordt toegepast op de GCaMP-uiten hersenen explant, en fluorescentie wijzigingen worden gecontroleerd door confocale microscopie. De betrokkenheid van de GPCR wordt vervolgens bevestigd door het uitvoeren van de dezelfde bepaling met behulp van een mutant hersenen ontbreekt de GPCR. Deze combinatie van beeldvorming en genetica biedt nauwkeurige informatie over de mededeling van de orgel-naar-orgel door peptiden-GPCRs. mogelijke modificaties en toepassingen van dit protocol worden ook besproken.

Protocol

1. bereiding van larvale hersenen explantaten Het maken van een imaging kamer.Opmerking: Stabiele opname vereist dat de hersenen explantaten worden aangebonden. Hier, een goedkope, handgemaakte imaging expositiekamer gebruik wordt gemaakt in de Ca2 + imaging systeem. Met behulp van Tang, kras midden onder in een schotel van kunststof cultuur (35 x 10 mm) te maken van een deuk voor het ventrale ganglion van de larvale hersenen waardoor montage eenvoudiger (stap 1.3, Fi…

Representative Results

Met behulp van dit protocol, werd de activering van de insuline-producerende hersencellen (IPCs) door de peptide hormonen, CCHa2, onderzocht. IPCs van de wild-type hersenen waren gelabeld met GCaMP6s met behulp van een combinatie van dilp2 -GAL412 (een geschenk van Dr. Rulifson) en UAS-GCaMP6s13 (een geschenk van Dr. Kim). Larvale hersenen explantaten werden behandeld met een synthetisch CCHa2 peptide, en de fluorescentie v…

Discussion

De Ca^{2 +} beeldvorming van de hier beschreven methode is een nuttig systeem voor het testen van de functie van hormonen in de hersenen. In vivo, de hersenen ontvangt hormonen van verschillende endocriene organen. Daarnaast ziet de hersenen voortdurend oplopende zintuiglijke informatie, waardoor spontane neuronale activering. Dit systeem ex vivo elimineert deze ruis en levert een betere signaal/ruis-verhouding dan in vivo imaging. In dit systeem, kunnen de moleculen worden getest afzon…

Materials

Tungsten rod	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	putty-like reusable adhesives
Watch glass, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	Phosphated buffered salts
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	water-immersion objective lens
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	N/A	piezoelectric-activated lens mover
Confocal Scanner Unit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan	CSU-W1	spinning disc confocal head
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	emission filter
µManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	U. S. National Institutes of Health	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne	N/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/