Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング
Summary
本稿では、ショウジョウバエの脳のカルシウム イメージング前のヴィヴォのプロトコルについて説明します。この方法で天然または合成化合物は、脳の特定の神経細胞をアクティブにする能力をテストするバッファーに適用できます。
Abstract
内分泌シグナルによる臓器に通信たとえば、脳に周囲からは恒常性を維持するために不可欠。内分泌研究のためのモデルとして、キイロショウジョウバエ、遺伝学的ツールとゲノム情報が洗練された、これがますます使用されています。この資料では、ショウジョウバエ脳外植体のカルシウム イメージング法について説明します。このメソッドは、脳にホルモンの直接シグナルを検出できます。多くのペプチッド ホルモン行動を通じて G タンパク質共役受容体 (Gpcr) が活性化は、細胞内 Ca2 +濃度の増加を引き起こすことが知られています。神経活性化は、細胞内の Ca2 +濃度 Ca2 +流入の Ca2 +細胞質網状質 (ER) に格納されているリリースからも高めます。カルシウム センサー、GCaMP は、これらの Ca2 +変更を監視できます。この方法で GCaMP は関心のニューロンで表現され GCaMP 表現する幼虫の脳は解剖、養殖前のヴィヴォ。テストのペプチドが脳植に適用されますし CCD カメラを装備して回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた GCaMP の蛍光変化を検出する.このメソッドを使用すると、任意の水溶性分子をテストことができますと適切な蛍光インジケーターを使用して神経の活性化に関連付けられている様々 な携帯電話イベントをイメージすることができます。また、他のショウジョウバエや他の動物の臓器を画像に、イメージングのチャンバーを変更すると、このメソッドを使用できます。
Introduction
臓器器官のコミュニケーションは、環境の変化に対処するための恒常性を維持するための進化上保存された戦略です。人間、内分泌腺からホルモン直火のさまざまな循環に。これらのホルモンの多くは代謝過程と1,2を供給など基本的な動作を調節する脳の視床下部をターゲットします。多くのホルモンは、哺乳類のモデルを使用して発見されています。しかし、彼らの行動は、彼らが参加、特に interorgan ネットワークのメカニズムはほとんど不明します。
キイロショウジョウバエは、臓器器官のコミュニケーションを研究するための有用なモデルとして登場しました。昆虫では、多くの生理学的なプロセスはホルモンによって制御されます。成長と変容に着目した初期の研究では、大型の昆虫を使用しました。これらの研究で削除または特定の臓器の移植は、臓器間のシグナリング分子の存在を予言その後、幼若ホルモン (JH)、Prothoracicotropic ホルモン (PTTH) とエクダイソン生化学的精製3,4,5をだった。細胞内情報伝達の大家族は、昆虫のライフ サイクル6、7の中に様々 な生理学的なイベントに関与すると考えられます。これらのペプチドのほとんどは、特定の Gpcr が従来のアプローチを使用して識別するために最初に困難な G タンパク質共役受容体 (Gpcr) に関する法律します。ショウジョウバエゲノム シーケンス8の出版物は、他の昆虫に見られる彼らの相同性に基づくショウジョウバエ生理活性ペプチドの同定に有効な画期的なだった。さらに、いくつかのペプチド受容体は、Gpcr 細胞・培養技術を用いた GPCR リガンド結合アッセイを使用してゲノムの予測から同定された.次に、発現解析は、これらのペプチド受容体によって誘発される臓器に経路を予測しました。特に、推定ペプチド受容体の多くは脳で脳はペプチド ホルモン9の主要なターゲットであることを示唆するいると表現されます。また、ショウジョウバエで高度な遺伝学的ツールは、ペプチド GPCR の組み合わせの生理的な役割の同定に貢献しました。例えば、GAL4 と LexA ベースのバイナリ転写システム時空間制御された方法では遺伝子ノックダウンまたは過剰発現を有効。 にします。酵母で識別される転写因子 GAL4 を上流活性化シーケンス (UAS) と呼ばれる特定のシス配列にバインドします。GAL4/UAS システム ドライバー ライン提供組織固有または段階における発現 GAL4 とレスポンダー ライン ドライブ shRNA 発現する構造や興味の遺伝子の上流の UAS を運ぶ。LexA/LexAop システムは、同様のメカニズムに基づいています。組織特異ペプチド ノックダウンおよび組織固有の GPCR ノックダウン動物の表現型解析は、ペプチド GPCR シグナル モードおよびアクションのサイトに関する情報を表示できます。ただし、遺伝的データによってだけ達することができる結論は制限されます。その一方で、特定のペプチド ホルモンの推定の対象は、組織または細胞の種類に絞られて、一度ペプチド GPCR シグナリングを介した臓器にコミュニケーションを明らかにする前のヴィヴォカルシウム器官外植体のイメージングを使用できます。Gq 共役 GPCR の活性化、ER10からの Ca2 +の放出による細胞内 Ca2 +濃度が増加します。脳神経の活性化はまた細胞内 Ca2 +濃度を高めます。このような Ca2 +増加はカルシウム センサー GCaMP は、Ca2 +蛍光発光11の結果の存在下での構造変化を経るによって検出できます。
この記事では、カルシウム イメージングを用いたショウジョウバエの脳外植片を説明します。特定のニューロンを作動するペプチドの機能をテストするテスト ペプチドは GCaMP 表現脳植に適用され、共焦点顕微鏡による蛍光の変化を監視します。GPCR が関与し、GPCR に欠けている突然変異体の脳を使用して同じアッセイを行って確認します。イメージングと遺伝学の組み合わせは、ペプチドによる臓器器官のコミュニケーションに関する正確な情報を提供しています-Gpcr。 可能な変更およびこのプロトコルのアプリケーションについても説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
Ca2 +イメージング法は、ここで説明した脳のホルモンの機能をテストするための便利なシステムです。生体内で、脳は様々 な内分泌腺からホルモンを受け取ります。さらに、脳は常に自発神経活性化を引き起こす感覚情報を昇順を認識します。この前のヴィヴォシステムは、このようなノイズを排除し、生体内イメージングより良い信号/ノイズ比が得られます。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は費補助金科学研究 (15 K 07147、17 K 07419) 日本学術振興会から (洋石本、佐野寛子) (HI) に稲盛財団研究助成金、共同利用・共同研究センターのプログラムでサポートされる発生発達医学分子発生学・遺伝学 (HS) に熊本大学研究所。イメージング システムを使用して彼らの助け、上川内あづさ先生と山田大地さんに感謝します。
Materials
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
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