꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

요약

우리 꼬마 선 충 의 생식. 의 3 차원 재구성 자동화 된 방법을 제시합니다 우리의 방법 수와 생식 및 분석 생식 단백질 분포 및 cytoskeletal 구조 내에서 각 핵의 위치를 결정합니다.

초록

꼬마 선 충 (C. 선 충) 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 및 염색체 역학을 포함 하 여 몇몇 생물학으로 중요 한 과정을 공부 하는 데 사용 됩니다. 동안에 생식은 우수한 모델, 분석은 종종 2 시간 및 3 차원 분석에 필요한 노동 차원. 이러한 연구에 주요 정보는 핵 및 단백질 분포는 생식 내 번호/위치. 여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 전산 접근을 사용 하 여 수는 생식의 각 지역에서 핵의 위치를 결정 하는 생식의 자동화 된 분석을 수행 하는 방법을 제시. 우리의 방법은 또한 다른 유전 배경의 단백질 식의 3 차원 검사를 가능 하 게 생식 단백질 분포를 분석 합니다. 또한, 우리의 연구는 특정 공간 발달 요구를 수용할 수 있는 생식의 고유 영역에서 cytoskeletal 건축에 변화를 보여줍니다. 마지막으로, 우리의 메서드는 각 생식의 spermatheca에 정자의 자동화 된 계산 수 있습니다. 함께 찍은, 우리의 메서드는 C. 선 충 생식의 신속 하 고 재현성 phenotypic 분석을 수 있습니다.

서론

포유류와 경로 신호의 보존은 C. 선 충 여러 생물 학적 과정^1,2를 공부 하는 우수한 모델. 우리의 실험실 사용 하 여 선 충 C. 생식 줄기 세포 개발, apoptosis, 유전자 발현 연구. 생식은 3 차원 구조, 많은 학문은 2 차원 3 차원 분석의 시간과 노동 집약적인 특성상. 2 차원 분석 vivo에서 이벤트는 생식에 허위로 수 있습니다 매우 높습니다. C. 선 충 성인 남녀 추 니 두 생식 팔, 각각의 집 체세포 원심 끝 셀 (DTC)는 미 분화 상태^3,4원심 세균 세포를 유지 하는. 이 세균 세포 차별화 영향력, 탈출 DTC에서 이동 하는 시작 되 고 해지고 oocytes 정자로는 생식의 근 위 끝에 도달. 이 과정 동안, 생식 세포 핵 유사 분열, 감수 분열^5,6에 전환 하기 전에 받아야. 정자 생산 후 oocytes는 성인 기 동안 생산 개발의 애벌레 단계 4 (L4)에 의해 완료 된다. 정자는 어디....

프로토콜

1. 준비 및 웜 농업

참고: 모든 제품 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.

1. OP50 대장균 문화: Lysogeny 국물 (파운드) (1% tryptone 0.5% 효 모, 0.5 %NaCl, pH 7.0) 항생제 없이 37 ° C에서 하룻밤에 OP50 박테리아 문화.
2. 선 충 류 성장 미디어 (NGM) 판 (1.5 g의 NaCl, 한 천, 펩, 1 M CaCl₂, 에탄올, 1 M MgSO₄ 의 1 mL에에서 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL의 1 mL의 1.25 g의 8.5 g OP50 박테리아의 400 µ L 씨 고 1 M KPO₄ 버퍼의 25 mL)와 공기 건조 48 h에 대 한 박테리아.
3. 시드 NGM 접시에 벌레를 선택 하 고 15 ° C 또는 20 ° C에서 품 어
   1. 성인 자웅 동체 생식의 분석을 위해 잘 먹이 L4 벌레 세균 잔디를 선택 하 고 20 ° c.에서 밤새 품 어
   2. 광고에 나온 것에 정자 수를 점수, 12 h 20 ° C에서 L4 벌레 벌레 L4/성인 탈피에 도달할 때까지 품 어. 동기화 하려면 L4 단계에 벌레, 표 백제....

결과

그림 1 3 차원 생식 분석에 필요한 시간을 나타냅니다. 20 ° C에서 incubated L4 광고에 나온 것 germlines를 분리 해 부 되었고 DAPI, phalloidin, 및 생식 단백질에 대 한 항 체와 스테인드. Germlines는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 얼룩 그리고 confocal 현미경 검사 법 완전 한 생식 필요 수 핵의 위치를 계산, 단백질 분포를 식별, 분석 cytoskeletal 구조와 점수를 10-15 분 약 24 h. 전산 분석 필요는 정자의 수입니다. 완전 한 수동 분석 생식 당 2 시간 이상 필요 연산자 영향에 따라, 따라서, 자동화 된 우리의 높은 처리량 방법 분석 시간 단축 및 재현성을 향상 시킵니다.

자동 핵 생식 팔 집 약 1000-12.......

토론

이 프로토콜의 목표는 정확도 개선 하 고 생식 분석에 필요한 시간을 줄일 것입니다. 준비 후에 표준 해 부 germlines의, 생식 핵의 3 차원 모델 렌더링 계산에 의해 준비 된다. 공간에 생식 핵 분포의 관찰 하면서 3 차원 렌더링은 생식의 특정 지역에서 핵의 수를 계산 합니다. 우리의 방법의 중요 한 측면 핵의 크기와 모양 매개 변수의 정확한 정의 이다. 이 얼룩이 지 고 사용 확대의 선명도에 따라 이미지를. 우리는 게시 된 데이터를 수동으로 분석¹에 비교 하 여 방법의 정확성을 확인 했다. 더욱 우리의 방법의 정확도 확인, 우리 다른 조건 하에서 여러 돌연변이 사용 하 고 게시 된 문학으로 결과 확인. 그것은 또한 미묘 하 고 강한 고기-감지 하는 방법의 능력을 확인 cpb-3 및 glp-1 돌연변이, 각각. 또한,이 방법은 핵 크기와 형태는 생식 또는 심지어 긴장 사이 변화에 적응력을 보여줍니다. 이 속성은 또한 id 및 염색체와 정자 등 생식.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C. elegans 균주: 야생형 (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli 박테리아	수제
선충 성장 매체 (NGM) 플레이트	수제
다클론 토끼 anti-REC-8	SDIX	29470002
Alexa 488 염소에서 생성된 복합 항체	Thermofisher Scientific	A-21236
염료 팔로이딘;	써모피셔 사이언티픽	A-12380
DAPI	써모피셔 사이언티픽	62248
폴리-L-라이신	시그마 알드리치	P5899
테트라미솔	Sigma Aldrich	P5899
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
1M HEPES 버퍼, pH 7.4	시그마 알드리치	G0887
10X PBS pH 7.4	써모피셔 사이언티픽	AM9625
트윈-20	Sigma Aldrich	P1389
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
37% 파라포름알데히드 용액	Merck Millipore	1040031000
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Fluoroshield 고정 시약	시그마 알드리치	F6182
에탄올	밀리포어
메탄올	시그마 Aldrich	34860
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