Vervoeging-geïnduceerde fluorescerende gepegyleerde virusachtige deeltjes door Dibromomaleimide-disulfide chemie maken
Summary
Hier presenteren we een procedure fluorescently functionalize de disulfides op Qβ VLP met dibromomaleimide. We beschrijven Qβ meningsuiting en zuivering, de synthese van dibromomaleimide-matiemaatschappij moleculen en de vervoeging reactie tussen dibromomaleimide en Qβ. Het resulterende gele fluorescerende geconjugeerd deeltje kan worden gebruikt als een fluorescentie sonde binnen cellen.
Abstract
De recente stijging van de virusachtige deeltjes (experimentele) in biomedische en onderzoek van materialen kan worden toegeschreven aan hun gebruiksgemak biosynthese, discrete grootte, genetische programmeerbaarheid en biologische afbreekbaarheid. Terwijl ze zeer vatbaar voor bioconjugation reacties voor het toevoegen van synthetische liganden op hun oppervlak, is het bereik in bioconjugation methodologieën op deze waterige geboren capsids relatief beperkt. Ter vergemakkelijking van de richting van functionele biomaterialen onderzoek, moeten niet-traditionele bioconjugation reacties worden beschouwd. De reactie beschreven in dit protocol maakt gebruik van dibromomaleimides om nieuwe functionaliteit in het oplosmiddel blootgestelde bisulfide obligaties van een VLP gebaseerd op bacteriofaag Qβ. Bovendien is het eindproduct TL, die heeft het extra voordeel van het genereren van een traceerbare in vitro sonde met behulp van een commercieel beschikbare filter set.
Introduction
Met behulp van virale capsids nano-sized heeft ontpopt als een spannende gebied, die gericht is op het verbreden van de reikwijdte van toepassingen in biomedisch onderzoek1,2,3. Recombinantly uitgesproken virusachtige deeltjes (experimentele) zijn structureel afgeleid van virussen, maar ze missen de oorspronkelijke virale genetische materiaal waardoor ze niet-infectieuze eiwithoudende nanodeeltjes. Aangezien de oppervlaktekenmerken zijn genetisch geprogrammeerd en elke Eiwitmantel identiek aan die voor en na het wordt uitgedrukt, is het mogelijk om te weten de locatie en het aantal reactieve zijketens van de aminozuren met atomistic precisie. In veel gevallen bezitten zowel het exterieur en interieur oppervlak vele soorten oplosmiddel blootgestelde aminozuurresidu’s, die redelijkerwijs kunnen worden matiemaatschappij door bioconjugation reacties – reacties die covalente bindingen tussen een Biomolecuul en een synthetische vormen molecuul4,5.
Bioconjugation reacties helpen biomoleculen van belang hebben diverser functionaliteiten op een relatief eenvoudige manier. Moleculen van belang, zoals therapeutische drugs6, fluorescerende labels7 en polymeren8,9 kunnen worden vooraf gesynthetiseerd en gekenmerkt voordat ze zijn aangesloten op het oppervlak van experimentele. Een bijzonder gemeenschappelijk VLP transferoefeningen biomedische en biomaterialen onderzoek geweest de VLP gebaseerd op bacteriofaag Qβ, die als recombinantly uitgesproken, is een 28 nm icosahedrale virale Eiwitmantel10. De meest voorkomende reactie sites op Qβ zijn lysines door een brede marge, hoewel wij hebben onlangs de succesvolle vervoeging11 van dibromomaleimide verbindingen aan de verminderde disulfides die lijn de poriën van Qβ via de reactie van een Haddleton-Baker meegedeeld. De reactie verloopt met een goede opbrengst en, even belangrijk, zonder verlies van de thermische stabiliteit van de deeltjes. Op hetzelfde moment genereert deze reactie vervoeging-geïnduceerde fluorescentie, die kan worden gebruikt voor het bijhouden van de opname van deze deeltjes in cellen. In dit werk tonen we de vervoeging van polyethyleenglycol (PEG) op het oppervlak van Qβ door de Haddleton-Baker-reactie, wat in een heldere gele fluorophore resulteert. Deze deeltjes kunnen vervolgens worden bijgehouden als ze worden genomen door de cellen. Het protocol hierin zal helpen genereren van nieuwe TL gepegyleerde eiwithoudende nanodeeltjes gebaseerd op Qβ, hoewel haar beginselen zijn van toepassing op een van de vele andere experimentele oplosmiddel blootgestelde disulfides met onderzoekers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vergeleken met kleinere EiwitReiniging, is een unieke stap in het zuiveren van de bacteriofaag Qβ de gradiënt centrifugeren van sacharose. Na de chloroform/n-butanol extractie stap, is Qβ verder gezuiverd met behulp van 5-40% sucrose verlopen. Tijdens centrifugeren, worden deeltjes gescheiden op basis van hun grootte. Grotere deeltjes reizen naar de hogere dichtheid regio, terwijl de kleinere deeltjes blijven in de lagere regio van de dichtheid. Qβ reist naar het onderste derde van het verloop en blijft er terwijl kl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.J.G. erkent de National Science foundation (DMR-1654405) en de kanker preventie Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) voor hun steun.
Materials
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4×1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated – Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. – Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. 생화학. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- . Pouring LB Agar Plates Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016)
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
