Facendo indotta da coniugazione PEGylated Virus-come le particelle fluorescenti di chimica Dibromomaleimide-disolfuro
Summary
Qui, presentiamo una procedura per funzionalizzare fluorescente disolfuri su Qβ VLP con dibromomaleimide. Descriviamo Qβ espressione e purificazione, la sintesi di molecole dibromomaleimide-funzionalizzate e la reazione di coniugazione tra dibromomaleimide e Qβ. La particella coniugata fluorescente gialla risultante utilizzabile come una sonda a fluorescenza all’interno delle cellule.
Abstract
Il recente aumento in particelle simili al virus (VLPs) in biomedica e ricerca dei materiali può essere attribuito alla loro facilità di biosintesi, dimensioni discrete, genetica programmabilità e biodegradabilità. Mentre sono altamente suscettibili di reazioni bioconjugation per l’aggiunta di ligandi sintetici sulla loro superficie, la gamma bioconjugation metodologie su questi capsidi nata acquose è relativamente limitata. Per facilitare la direzione della ricerca di biomateriali funzionali, sono da considerarsi reazioni bioconjugation non tradizionali. La reazione descritta in questo protocollo utilizza dibromomaleimides per introdurre nuove funzionalità nel solvente legami bisolfurico esposte di un VIP basati su Qβ del batteriofago. Inoltre, il prodotto finale è fluorescente, che ha il vantaggio di generare una sonda rintracciabile in vitro utilizzando un set di filtri disponibili in commercio.
Introduction
Utilizzando nano-dimensioni capsidi virali è emerso come un campo emozionante, che mira ad ampliare la portata delle applicazioni nella ricerca biomedica1,2,3. Recombinantly espresse particelle simili al virus (VLPs) sono strutturalmente derivate dai virus, ma mancano il materiale genetico virale originale che li rende non infettive nanoparticelle proteinica. Come le caratteristiche della superficie sono geneticamente programmate e ogni capside è espresso in modo identico a quelli prima e dopo di esso, è possibile conoscere la posizione e il numero delle catene laterali reattivi degli aminoacidi con precisione atomistica. In molti casi, entrambe le superfici interne ed esterne possiedono molti generi di solvente esposta dell’amminoacido residui che possono essere funzionalizzati concretamente attraverso reazioni di bioconjugation – reazioni che formano legami covalenti tra una biomolecola e un sintetico molecola4,5.
Reazioni di bioconjugation aiutano biomolecole di interesse hanno funzionalità più diversificata in modo relativamente semplice. Molecole di interesse, come farmaci terapeutici6, fluorescente tag7 e polimeri8,9 possono essere pre-sintetizzati e caratterizzati prima sono attaccati sulla superficie di VIP. Un VLP particolarmente comune in biomedica e biomateriali la ricerca è stata la VLP basato su batteriofago Qβ, che, come recombinantly espresso, è un 28 nm icosaedrica del capside virale10. I più comuni siti di reazione su Qβ sono lisine con un ampio margine, anche se recentemente abbiamo comunicato la coniugazione successo11 dibromomaleimide composti per la ridotte disolfuri che costeggiano i pori di Qβ tramite una reazione di Haddleton-Baker. La reazione procede con una buona resa e, altrettanto importante, senza perdere la stabilità termica delle particelle. Allo stesso tempo, questa reazione genera fluorescenza indotta da coniugazione, che può essere utilizzato per monitorare l’assorbimento di queste particelle nelle cellule. In questo lavoro, dimostriamo la coniugazione di polietilenglicole (PEG) sulla superficie del Qβ attraverso la reazione di Haddleton-Baker, che si traduce in un fluoroforo giallo brillante. Queste particelle possono essere monitorate quindi come si sono presi dalle cellule. Il protocollo qui aiuterà i ricercatori a generare nuova pegilato fluorescente proteinica nanoparticelle basate su Qβ, anche se i suoi principi sono applicabili ad uno di molti altri VIP contenente solvente disolfuri esposte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rispetto al più piccolo purificazione della proteina, un unico passo a depurare il batteriofago Qβ è la centrifugazione in gradiente di saccarosio. Dopo la fase di estrazione di cloroformio/n-butanolo, Qβ viene ulteriormente purificato usando 5-40% pendenze del saccarosio. Durante la centrifugazione, le particelle vengono separate in base alle loro dimensioni. Le particelle più grandi in viaggio per la regione di densità superiore, mentre le particelle più piccole soggiorno nella regione più bassa densità. Qβ v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.J.G. riconosce la National Science foundation (DMR-1654405) e cancro Prevenzione Research Institute del Texas (CPRIT) (RP170752s) per il loro sostegno.
Materials
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4×1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated – Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. – Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. 생화학. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- . Pouring LB Agar Plates Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016)
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
