연령에 따라 모터 손상 Neurodegeneration와 쥐의 걸음 걸이 분석

Summary

이 연구에서 우리 복 부 비행기 모터 조정 마우스 모델 (예를 들어, endophilin 돌연변이 나이 진출 neurodegeneration의 진행에 미묘한 변화를 모니터링 하 이미징 기반 운동학 걸음 걸이 분석의 사용을 보여 줍니다. 마우스 라인)입니다.

Abstract

모터 동작 테스트는 일반적으로 설치류 모델의 기능적인 관련성을 결정 하는 데 사용 됩니다 고 새로 테스트를이 동물 치료를 개발 했다. 특히, 걸음 걸이 분석 탈환 질병 관련 고기 인간 환자에서 특히 파 킨 슨 병 (PD), Alzheimer의 질병 (광고), 루 모터 능력에 영향을 주는 신경 퇴행 성 질환에서에서 관찰 되는 수 옆 경화 증 (ALS), 그리고 다른 사람입니다. 초기 연구에서이 라인을 따라, 걸음 걸이 매개 변수 측정 힘들고 않는 제어 요소에 의존 했다 (예를 들어, 실행 속도, 연속 실행). 복 부 평면 영상 (VPI) 시스템의 개발이 했다 설치류에이 방법은 모터 동작의 평가 대 한 유용한 도구를 만드는 대규모에서 걸음 걸이 분석을 수행 가능. 여기, 선물이 운동학 걸음 걸이 분석을 사용 하 여 검사 neurodegeneration;의 마우스 모델에서 모터 적자의 연령에 따라 진행 하는 방법의 심층 프로토콜 예를 들어 마우스 라인 endophilin는 점차적으로 신경 손상이 나이, 증가의 감소 수준으로 사용 됩니다.

Introduction

신경 퇴행 성 질환 환자, 가족, 그리고 사회에 상당한 부담을 부과 하 고 평균 수명이 증가 함에 따라 더욱 우려 될 것 이다 세계 인구 나이 계속. 신경 퇴행 성 질환의 가장 흔한 증상 중 하나는 균형 및 이동성 문제입니다. 따라서, 노화 포유류 모터 동작 (예: 쥐)의 특성화 모델, 또는 신경 고기를 보여주는 모델 이다 vivo에서 관련성 특정 동물 모델, 또는 치료를 설명 하는 유용한 도구 치료 질병 증상을 개선 하는 것을 목표로입니다. 거의 모든 접근 신경 퇴행 성 질환을 치료 하는 궁극적으로 인 간에 있는 임상 시험의 개시 전에 동물 모델에서 테스트 필요 합니다. 따라서, 그것은 중요 한 생체 외에서 모델에 잠재적인 보였다, 후보 약물 수 있도록 일관 되 게 나이 진행에 따라 질병 관련 고기 척도를 사용할 수 있는 안정적이 고 재현 동작 테스트를 효과적으로 살아있는 동물에서 표현 형 개량.

운동학 적 보 행 분석, VPI (또한 불린된 복 부 비행기 videography)^1,2에 의해 실행 될 수 있는 설치류에서 모터 동작 평가입니다. 이 설립된 메서드는 투명 하 고 자동화 된 디딜 방 아 벨트^1,2,,34위에 걷는 설치류의 아래쪽의 연속 녹음에 대문자로 바꿉니다. 비디오 피드 데이터의 분석이 만듭니다 “디지털 발 인쇄” 동적으로 하 고 확실 하 게 정리 케 일 외 에 의해 원래 설명으로 설치류의 걷는 패턴, 모든 4 개의 사지의 ² , Amende 외. ³.

이미징 기반 걸음 걸이 분석의 원리는 각 개별 발에 대 한 시간 동안 디딜 방 아 벨트를 접촉 하 여 발 면적을 측정 이다. 모든 입장은 (브레이크 단계)에서 발 지역과 (추진 단계)에서 발 지역에서 감소의 증가 의해 표시 됩니다. 이것은 신호가 감지 되는 스윙 단계 옵니다. 스윙과 함께 자세는 보 폭을 형성합니다. 걸음 걸이 역학 매개 변수 외에 자세 매개 변수 또한 기록 된 비디오에서 추출할 수 있습니다. 모범적인 매개 변수 및 그들의 정의 표 1 에 나열 된 고 자세 폭 (남서, 주 둥이-꼬리 축 앞 또는 뒷 발에서 결합 된 거리)를 포함, 길이 (SL; 같은 발의 두 진보 사이의 평균 거리), 보 폭 또는 발 배치 각도 (주 둥이-꼬리 축 발의 각도). 자세와 걸음 걸이 역학 데이터 그리기 결론 (자세 매개 변수 및 여러 단계를 통해 그들의 변화)에 의해 동물 균형 및 조정 (걸음 걸이 역학 매개 변수)에 의해 허용. 증 계수 (SL 가변성 [(최대 계산 같은 다른 매개 변수 SL−min입니다. SL) / SL을 의미]), 뒷 다리 공유 입장 시간 (두 뒷 다리 사지는 벨트와 접촉 시간), 발 (전체 면적의 이륙에 발을 전체 입장에서 벨트에 발) 추출도 수 끌어서 다양 한 신경 디 변경 될 보고 되었습니다 또는 sease 모델^5,6,,78 ( 표 1참조).

매개 변수	단위	정의
스윙 시간	ms	앞 발은 벨트 접촉 기간
입장 시간	ms	발 벨트 접촉 하는 기간
% 브레이크	입장 시간 %	입장 시간 발 브레이크 단계에서의 비율
% 추진	입장 시간 %	입장 시간 발 추진 단계에서의 비율
자세 폭	cm	주 둥이-꼬리 축 앞 또는 뒷 발에서 결합된 거리
보 폭 길이	cm	같은 발의 두 진보 사이의 평균 거리
보 폭 주파수	진보/s	초당 완료 진보 수
발 배치 각도	deg	동물의 주 둥이-꼬리 축에 관하여 발의 각도
증 계수	거리	[(Max SL-min SL)/평균 SL SL 변화 계산]
% 공유 자세	자세의 %	뒷 다리 공유 입장 시간; 두 뒷 다리 사지 벨트 접촉 동시에 시간
드래그를 발	m m2	이륙에 발을 전체 입장에서 벨트에 발의 총 면적
사지 로드	cm2	MAX dA/dT; 주요 단계에서 발 영역의 변화의 최대 속도
단계 각도 변화	deg	SL 및 소프트웨어의 기능으로 표준 편차는 뒷 다리 사이의 각도의 발

표 1입니다. 복 부 비행기 상상에 의해 테스트할 수 있는 주요 보 행 매개 변수 정의입니다.

신경 퇴행 성 질환에 대 한 설치류 모델의 모터 동작 평가 주어진된 나이에 특정 모델의 표현 형의 심각도 따라 도전적 될 수 있다. 여러 질병, 가장 눈에 띄게 PD, 쇼 강한 모터 동작 (운동) 적자, 환자와 동물 모델 둘 다. PD에 4 개의 주요 증상 중 하나 bradykinesia 노화와 함께 진행 하 고 PD⁹의 초기 단계에서 이미 심한 보 행 장애에 명단입니다. 급성 PD 모델, 설치류 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), 치료의 연구는 이미 VPI 걸음 걸이 분석^10,,1112를 사용 했습니다. 그러나,이 모델의 심각한 성격을 감안할 때, 이러한 연구 할 다루지 모터 적자의 연령 관련 진행. 여러 최근 연구 예^13,14,15, 나이 발전으로 질병의 진행을 이해의 관련성을 강조 신경 퇴행 성 변화, 세 쥐에서 걸음 걸이 분석 실시 .

모터 적자 뿐만 아니라 신경 퇴행 성 질환의 동물 모델 종종 어려움 시험 작업에 초점을 맞추고 있고 나이 진출 특히 저명한 인지 장애를 보여. 이러한 표현 형 모터 동작 테스트의 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 즉, 모터 적자, rotarod 테스트¹⁶, 검사를 가장 널리 사용 되는 테스트 중 하나는 인식, 관심, 그리고 스트레스^17,18에 의존 합니다. 자동화 된 디딜 방 아에 걸어 지는 또한 이러한 요인에 따라 달라 집니다, 그러나는 더 표준화 된 기능으로 기록된 읽어 실행 하 고 훨씬 덜 변경된 인식에 의해 영향을. 스트레스와 관심의 효과 전반적인 실행 능력에만 스트레스, 그리고 관심^19,20, SL에 대 한 스윙/입장 시간 같은 특정 매개 변수를 볼 수 있습니다.

운동학 걸음 걸이 분석 접근 더 설치류 모델에 대 한 도전을 조정 하는 옵션의 이점을 제공 합니다. 가변 각도와 속도 디딜 방 아 0.1-99.9 cm에서에서 속도 걸어 수 있습니다/s, 그렇게 심한 걷는 장애가 있는 설치류 느린 속도로 실행할 수 있습니다 (~ 10 cm/s). 비 장애인 동물 빠른 실행 속도에서 측정 될 수 있다 (30-40 cm/s). 시험된 동물 특정 속도에서 실행할 수 여부의 관찰 자체 결과를 제공 합니다. 또한, 설치류 경사, 또는 감소, 아래로 기우는 각도의 도움으로 원하는 각도에 디딜 방 아 또는 마우스 또는 쥐 뒷 다리 사지를 가중치 썰매를 연결 하 여 실행 또한 도전 될 수 있습니다.

환자에 있는 변이 단일 단백질의 다 수의 연구, 이외에 결함이 endocytosis 과정과 neurodegeneration^{13,,2122, 사이 연결의 최근 증가 인식 23,,2425,26,27,28}. Endophilin-A의 감소 된 수준의 모델 마우스 (이제부터 endophilin), 두 clathrin 중재 된 endocytosis^{13,,2129,30,31} 에서 키 플레이어 ^{, 32 , 33 , 45} 와 clathrin 독립적인 endocytosis³⁴, neurodegeneration 및 연령에 따라 장애 운동 활동^13,21보여을 발견 했다. 3 유전자 인코딩 endophilin 단백질의 가족: 1, endophilin 2, endophilin 및 endophilin 3. 특히, endophilin 단백질의 고갈에서 유래 하는 형 수에 따라 크게 차이가 없는 endophilin 유전자^13,21의. 테스트에 대 한 3 endophilins에 대 한 단일 코 아무 명백한 표현 형을 보여줍니다 동안 트리플 녹아웃 (KO) 모든 endophilin 유전자의 치명적인 출생, 그리고 모두 endophilin 1, 2 번 창 하 고 출생 후 3 주 이내에 죽을 실패 없이 마우스 후 불과 몇 시간, 조건²¹. 다른 endophilin 돌연변이 genotypes 수명 감소를 표시 하 고 나이¹³증가 함께 모터 장애를 개발. Endophilin 1KO-2HT-3KO 쥐 디스플레이 걷는 변경 및 모터 조정 문제 (운동학 걸음 걸이 분석 및 rotarod에 의해 테스트)으로 3 개월, 그들의 littermates, 동안에 이미 endophilin 1KO 2WT 3KO 동물, 중요 한 표시 나이¹³의 15 개월만에 모터 조정의 감소. 로 인해 이러한 모델에 고기의 광대 한 다양성, 그것은 식별 하 고 다양 한 과제에 해당 하는 나이 뿐만 아니라 동물의 모터 및 인지 능력, 통합할 수 있는 테스트를 적용 하는 데 필요한. 여기, 우리 선발 실험 절차 개시 및 신경 퇴행 성 변화 (즉, endophilin 돌연변이)를 표시 하는 마우스 모델에서 모터 손상의 진행을 평가 하기 위해 운동학 걸음 걸이 분석에 활용. 이 다양 한 연령과 운동 장애의 다른 심각도에 걸음 걸이 파라미터를 측정을 포함 됩니다.

Protocol

여기에서 보고 된 모든 동물 실험 동물 복지에 대 한 유럽 지침에 따라 실시 하 고 있습니다 (2010/63/EU) Niedersächsisches Landesamt 위한 Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), 등록 번호 14에 의해 승인 / 1701입니다. 1. 연구 설계 동물 행동 작업 필요로 신중 하 게 계획, 실험을 디자인 하는 동안 다음 매개 변수를 고려 하십시오. 그룹 당 필요한 동물의 수입니다. ?…

Representative Results

운동학 걸음 걸이 분석의 사용을 설명 하기 위해 우리가 수행한 걸음 걸이 분석 WT C57BL/6J 쥐 나이, 뿐만 아니라 여러 endophilin 돌연변이 라인, 진출에 상용 계측 및 소프트웨어를 사용 하 여 ( 표를 참조 하십시오의 재료). 이 설정에서 투명 한 디딜 방 아에서 고속 카메라 마우스 (그림 1A)의 실행을 기록합니다. 소프트웨어는 다음 붉은 색된…

Discussion

모터 조정 공부 하는 것은 신경 퇴행 성 질환, 특히 PD는 모터 조정 심각 하 게 영향을 같은 질병에 대 한 모델의 특성에 유용한 접근 이다. 운동학 걸음 걸이 분석 기능 분석 결과의 도움으로, 우리 약한 neurodegeneration와 따라서 상대적으로 겸손 한 표현 형의 운동 문제, 발병에 동물의 걸음 걸이 또는 모델에 미묘한 변화를 식별할 수 있습니다. 작은 걸음 걸이 이상이 고 심한 운동 장애를 포함 하는 ?…

Materials

DigiGait	Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA		DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware
non-transparent blanket or dark cloth			cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress
balance	e.g. Satorius		balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g
red finger paint	e.g. Kreul or Staedtler		for increasing the contrast between paws and animal’s body
small paint brush			soft brush to apply finger paint to the animal paws
diluted detergent			for cleaning
disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol	e.g. B.Braun		for desinfection