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Immunology and Infection

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリン アイソタイプ反応の評価

Published: September 07, 2018
doi:
10.3791/57843
, ,
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology,Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience,Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

本稿では elisa 法を用いたマウスの T に依存し、T 独立免疫グロブリン (Ig) アイソタイプを特徴付けるためのプロトコルについて述べる.このメソッドは、単独で使用またはフローと組み合わせてフローサイトメトリーは T に依存し、T 独立した抗原免疫したマウスの B 細胞の Ig アイソタイプ応答の違いを識別するために研究者をできるようになります。

Abstract

抗体、免疫グロブリン (Ig) から分泌される分化 B リンパ球、plasmablasts/プラズマ細胞、体液性免疫とも呼ばれますは、多様なメカニズムを介して病原体の侵入に対する恐るべき防衛を提供します。予防接種の 1 つの主要な目標は、生命にかかわる伝染を防ぐために防御抗原特異的抗体を誘導するためです。胸腺依存 (TD) と胸腺に依存しない (TI) 抗原の堅牢な抗原特異的 igm 抗体応答を引き出すことができる助けを借りてメモリー B 細胞の世代だけでなく、アイソタイプ切り替え抗体 (IgG, IgA, IgE) の生産を誘発するも両方抗原提示細胞 (APCs) によって提供されます。ここでは、酵素免疫測定法 (ELISA) を用いたマウスにおける TD と TI Ig アイソタイプ反応を特徴付けるためのプロトコルについて述べる。このプロトコルでは TD と TI Ig 反応が誘発されるマウスの腹腔内 (i. p.) ハプテン共役モデル抗原 (ミョウバン) の TNP KLH TNP 多糖類 (PBS) で免疫によるそれぞれ。TD メモリ応答を誘導して、ミョウバンの TNP KLH のブースター接種が同じ抗原/アジュバント最初の予防接種後 3 週間で与えられます。マウス血清は、予防接種の前後に、異なる時点で収穫されます。総血清 Ig と TNP 特異的抗体がそれぞれ Ig アイソタイプ特異サンドイッチと間接 elisa 法を用いたを定量化してその後。正しく各の Ig アイソタイプの血清濃度を定量化するために、サンプルは標準曲線の線形の範囲に収まるように適切に希釈する必要があります。このプロトコルを使用して、高い特異性と感度で信頼性の高い結果を一貫して取得しております。Cytometry 流れ、体外培養脾細胞の免疫組織化学的など他の補完的な手法と組み合わせて使用されるとき染色 (IHC)、このプロトコルは、抗体の包括的な理解を得るために研究者与えられた実験の設定に応答します。

Introduction

B リンパ球は、体液性免疫の主プレーヤーと抗体、免疫グロブリン (Ig)1,2とも呼ぶことができる哺乳類で唯一セル型です。B 細胞から分泌される抗体は中和、オプソニン化、補体の活性化、防御免疫3につながるなど多様なメカニズムを介して病原体の侵入に対する恐るべき防衛を提供します。B 細胞による抗体の分泌は通常 2 つの個別の3信号を必要とする特定の B 細胞の完全な活性化後のみ達成されます。信号 1 は B 細胞受容体 (BCR)3特定ナイーブ B 細胞の表面に発現する抗原 (Ag) の直接結合によって中継されます。信号 2 のソースによって B 細胞の活性化を胸腺依存 (TD) または胸腺非依存性 (TI)3,4に分けることができます。TD 抗原応答信号 2 は活性化血続き CD4 T ヘルパー (TH) 細胞、CD154、共刺激受容体 B 細胞1,2,3に発現する CD40 リガンドを表現するによって提供されます。TI 抗原応答 Toll 様受容体のいずれかの婚約から来る信号 2 (タイプ 1 の場合 Tlr TI Ag)、BCRs の広範な架橋または (タイプ 2 の場合 TI Ag) B 細胞3,4。1 型チタン (TI-1) 抗原は、Tlr は、細菌リポ多糖 (LPS)、ウイルス Rna と微生物 CpG DNA4,5などの微生物配位子です。2 型チタン (TI-2) 抗原反復性の高い構造をしているし、長引くと永続的な複数 BCRs4,6架橋した B 細胞にシグナルを配信することができます。TI 2 抗原の典型的な例には、肺炎球菌多糖類および多糖類のハプテン共役6,7があります。TD と TI の抗原は堅牢な抗原特異的 igm 抗体応答を引き出すことができるし、抗原提示細胞 (APCs) 樹状細胞 (Dc)1 などによって提供される助けを借りてアイソタイプ切り替え抗体 (IgG, IgA, IgE) の生産を誘導するも、2,3。さらに、TD と TI の抗原は Apc の助けを借りてメモリ反応を誘導することができるが TD 抗原は、メモリー B 細胞世代3、8を誘導で効率的です。

このプロトコルでは TD と TI Ig 応答がハプテン共役モデル抗原 2,4,6 trinitrophenyl 鍵穴カサガイ ヘモシアニン (TNP KLH) と TNP 多糖類 (ニュートラル、高度分岐腹腔内 (i. p.) 予防接種でマウスで誘発されます。高質量)、それぞれ9,10,11。TD 抗原は抗体12の生産を高めるためにアジュバントで通常使用されます。ここで私達のプロトコル、ミョウバン、予防接種研究12で一般的に使用される補助との TNP KLH を注入します。使用することができますアジュバントの他の例は、(CFA や対仏投資庁) に Freund のアジェバント完全なまたは不完全な monophosphoryl 脂質 A/トレハロース結核 (」Ribi「アジュバント) と CpG オリゴデオキシヌクレオチド、等13, 14. 予防接種後マウス血清中の異なる時点で収穫され、血清中の TNP 特異的抗体は、Ig アイソタイプ特異酵素抗体法 (ELISA)9,10,を用いて定量化が11。

Elisa 法は、医学の診断ツールとして、また生物医学研究15,16の分析的なツールとして広く使用されているプレート ベースのアッセイです。検出し、抗体、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、さまざまな抗原、等を含む検体を定量化するものです。ELISA は、直接的、間接的、サンドイッチと競争力のある ELISA15,16を含むいくつかの異なる形式で実行できます。一般に、一次抗体とインキュベートする 96 ウェル マイクロ プレート通常、固体表面に抗原を固定化が含まれます。インキュベーション後、非連結の抗体は洗い流されました。信号検出器によって検出されたように表示色の変更を生成する発色性基質を切断することができます酵素 (通常西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ) に直接 ELISA の一次抗体を直接活用します。分光光度計15,16。対照的に、酵素の二次抗体を一次抗体をバインドする使用する場合、この間接 ELISA15,16として考慮されます。間接 elisa 法はより敏感な15,16に対し、ELISA は高速です。サンドイッチ elisa 法、プレートは、サンプルでは、興味の抗原を固定化するために使用「キャプチャ」抗体でコーティングされて直接的または間接的な方法15,のもう一つの「検出」抗体によってキャプチャされた抗原を検出できるし、16. 抗原は抗原の 2 つの異なる抗体によって検出されるので、サンドイッチ elisa 法は高い特異性を提供しています。競合 ELISA のサンプルの抗原と一次抗体へのバインディングのプレート連結抗原間競争が確立し、基板からの信号の減少を測定することによってサンプル中の抗原濃度を定量化するし15,16. 競合 elisa 法上記の直接的または間接的な形式を使用して実行することができます、1 つだけエピトープ15,16小さな抗原の検出に便利です。

抗体の測定のための代替技術ほか、ラジオ ・ イムノアッセイ (RIA)、電気化学発光 (ECL) 測定と表面プラズモン共鳴 (SPR) 法17。RIA は、その対策を開発最初の免疫測定法で、高い特異性と感度の標識試薬18,19を使用して抗原 (または抗体) の存在だった。しかし、放射性毒性、処分費用、貯蔵寿命、放射性物質を操作する特別なライセンスの問題のため elisa 法はより良い、普通のより便利な手法を使用して、20,21。ECL は化学発光反応が電極の表面に安定した前駆体から高反応性の種を生成する電気を使用して開始し、検体の量を測定するための高感度定量 (抗原などや抗体)22。ただし、ECL 特別な機器が必要です、したがって、広くされている ELISA23。SPR は配位子の結合を測定する使用ことができます直接試金 (e.g。、抗体) に分子を固定化 (e.g。、抗原) センサー チップ表面の24。SPR は、リアルタイムでの相互作用を検出すると、非常に具体的と ELISA のように標識試薬の使用を必要としません。しかし、SPR はまた特別な機器が必要です、ELISA17よりも感度が低い。代替方法の限界を考えると、ELISA は、この議定書の目的のため最も適した、便利な手法です。ここでは、合計の Ig アイソタイプ レベルの解析および間接 elisa による抗原特異的免疫グロブリンアイソ タイプの分析のプロシージャのサンドイッチ elisa 法の使用について述べる。

Protocol

このプロトコル ラトガース大学の制度上の動物の研究倫理委員会のガイドラインに従います。すべてのマウスは NIH のガイドラインに従って機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された動物の議定書の下で使用されています。 1. マウスと素朴なマウス血清のコレクションの準備 特定動物病原体フリー施設の予防接種実験のためのすべてのマウスを維持しま…

Representative Results

我々 は TI と TD の Ig アイソタイプ応答9,10,11免疫システム TRAF3 の重要な調節因子の役割を調査するのにこのプロトコルを使用しています。TRAF3 直接的または間接的数 TNF 受容体スーパーファミリーを含め自然免疫と適応免疫受容体のシグナル伝達を調節する、Toll 様受容体と T 細胞受容体/CD28、とり…

Discussion

ここでは、elisa 法を用いたマウスの TD と TI の Ig アイソタイプ応答特性プロトコルについて述べる。このプロトコルの実装を成功させるには、テーブル 1、ELISA アッセイ プレート、予防接種 Ags、マウス Ig アイソタイプ特異的抗体基準などに指定された材料の使用が必要です。処理組織培養皿を用いた elisa 法を避けるために注意が必要があります。標準および血清サンプルの希?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、国立衛生研究所健康補助金 R01 CA158402 (P. 謝) によって支えられた、R21 AI128264 (P. Xie) は、国防総省の付与 W81XWH-13-1-0242 (P. 謝) パイロット賞助成番号 P30CA072720 を通じてのニュージャージーのがん研究所から国立がん研究所 (P. 謝)、ブッシュ医グラント (P. 謝)、ビクター Stollar フェローシップ (A. Lalani) とアン *、ジェームス b. Leathem ・ フェローシップ (s. 朱)。

Materials

VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2
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Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).
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