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Immunology and Infection

Caratterizzazione delle risposte di isotipo dell'immunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando l'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente

Published: September 07, 2018
doi:
10.3791/57843
, ,
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology,Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience,Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

In questo articolo, descriviamo un protocollo per caratterizzare le risposte di isotipo dell’immunoglobulina (Ig) T-dipendenti e T-indipendente in topi usando ELISA. Questo metodo usato da solo o in combinazione con flusso cytometry permetterà ai ricercatori di identificare le differenze nelle risposte di isotipo Ig B cellulo-mediata nei topi dopo immunizzazione antigene T-dipendente e T-indipendente.

Abstract

Anticorpi, anche definiti come differenziano immunoglobuline (Ig), secernute dai linfociti B, cellule di plasmablasts/plasma, nell’immunità umorale forniscono una formidabile difesa contro l’invasione patogeni tramite diversi meccanismi. Uno degli obiettivi principali della vaccinazione è di indurre anticorpi protettivi di antigene-specifiche per prevenire le infezioni pericolose per la vita. Timo-dipendenti (TD) e gli antigeni timo-indipendenti (TI) possono suscitare risposte antigene-specifiche IgM di robuste e possono anche indurre la produzione di anticorpi isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) così come la generazione di cellule B di memoria con l’aiuto fornito dalla (APCs) di cellule presentanti l’antigene. Qui, descriviamo un protocollo per caratterizzare le risposte di isotipo TD e TI Ig nei topi utilizzando analisi enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA). In questo protocollo, TD e TI Ig risposte sono tratte in topi tramite intraperitoneale (i.p.) immunizzazione con antigeni coniugato aptene modello TNP-KLH (in allume) e TNP-polisaccaride (in PBS), rispettivamente. Per indurre la risposta di memoria TD, un’immunizzazione di booster di TNP-KLH in allume è dato a 3 settimane dopo la prima immunizzazione con l’antigene stesso/adiuvante. Sieri di mouse vengono raccolte in diversi momenti prima e dopo l’immunizzazione. I livelli del siero Ig totali e anticorpi specifici per TNP successivamente sono quantificati tramite Ig specifici Sandwich ed ELISA indiretto, rispettivamente. Per quantificare correttamente la concentrazione nel siero di ogni isotipo Ig, i campioni devono essere opportunamente diluito per adattarsi all’interno della gamma lineare delle curve standard. Usando questo protocollo, abbiamo ottenuto sempre risultati affidabili con sensibilità e alta specificità. Quando usato in combinazione con altri metodi complementari quali la citometria a flusso, cultura in vitro di cellule di B spleniche e immunohistochemical che macchiano (IHC), questo protocollo permetterà ai ricercatori di acquisire una comprensione globale dell’anticorpo risposte in una determinata impostazione sperimentale.

Introduction

I linfociti B sono il principale attore in immunità umorale e l’unico tipo di cellula in mammiferi che sono in grado di produrre anticorpi, anche definiti come le immunoglobuline (Ig)1,2. Gli anticorpi secernuti dalle cellule di B forniscono una difesa formidabile contro l’invasione patogeni tramite diversi meccanismi di neutralizzazione, opsonizzazione e l’attivazione del complemento, che conduce a un’immunità protettiva3. Secrezione di anticorpi dalle cellule di B si raggiunge solo dopo la completa attivazione di cellule B specifiche, che normalmente richiede che due distinti segnali3. Segnale 1 viene inoltrato da binding diretto dell’antigene (Ag) per il recettore delle cellule B (BCR) espresso sulla superficie delle cellule di B ingenui specifiche3. A seconda della fonte di segnale 2, attivazione delle cellule B può essere suddivisa in timo-dipendenti (TD) o timo-indipendenti (TI)3,4. In risposta all’antigene un TD, segnale 2 è fornito da attivato cognate CD4 linfociti T helper (TH), che esprimono CD154, il ligando per il recettore co-stimolatore CD40 espresso sulle cellule di B1,2,3. In risposta all’antigene una TI, 2 segnale proviene da entrambi fidanzamento dei Toll-like receptors (TLRs nel caso tipo 1 TI Ag) o cross-linking vasto del BCRs (nel caso di tipo 2 TI Ag) sulla B cellule3,4. Gli antigeni di TI (TI-1) di tipo 1 sono microbiche ligandi dei TLR, inclusi lipopolisaccaridi batterici (LPS), RNA virale e microbica CpG DNA4,5. Gli antigeni di TI (TI-2) di tipo 2 hanno struttura altamente ripetitiva e sono in grado di fornire prolungata e persistente segnalazione alla cella B da più cross-linking del BCRs4,6. Tipici esempi di antigeni TI-2 pneumococcici polisaccaridi e polisaccaride coniugato aptene6,7. Gli antigeni sia TD e TI possono suscitare risposte antigene-specifiche IgM di robuste e possono anche indurre la produzione di anticorpi isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) con l’aiuto fornito dall’antigene che presenta le cellule (APCs) quali le cellule dendritiche (DCs)1 ,2,3. Inoltre, gli antigeni sia TD e TI sono in grado di indurre risposte di memoria con l’aiuto di APC, ma gli antigeni TD sono più efficienti a indurre la memoria delle cellule di B generazione3,8.

In questo protocollo, TD e TI Ig risposte sono tratte in topi tramite immunizzazione intraperitoneale (i.p.) con emocianina di modello aptene coniugato antigeni 2, 4,6-trinitrophenyl-keyhole limpet (TNP-KLH) e TNP-polisaccaride (neutro, molto ramificato e a massa elevata), rispettivamente9,10,11. Gli antigeni TD sono usati solitamente con un adiuvante per migliorare la produzione di anticorpi12. Qui nel nostro protocollo, TNP-KLH viene iniettato con allume, un adiuvante comunemente utilizzato in studi di immunizzazione12. Altri esempi di coadiuvanti che possono essere utilizzati completa o incompleta l’adiuvante di Freund (CFA o IFA), monofosforil-lipidico A / trehalose dicorynomycolate (“Ribi” adiuvante) e CpG oligodeoxynucleotides, ecc.13, 14. dopo immunizzazione, sieri del mouse sono stati raccolti in diversi momenti e gli anticorpi di TNP-specifici nel siero sono quantificati tramite Ig specifici enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) dosaggio9,10, 11.

ELISA è un saggio basato su piastra che è ampiamente usato come uno strumento di diagnostica in medicina e anche come strumento analitico in ricerca biomedica15,16. Esso viene utilizzato per rilevare e quantificare analiti compresi gli anticorpi, ormoni, citochine, chemochine e vari antigeni, ecc. ELISA può essere eseguita in diversi formati, tra cui diretto, indiretto, panino e competitivo ELISA15,16. In generale, coinvolge l’immobilizzazione dell’antigene ad una superficie solida, solitamente una piastra microtiter a 96 pozzetti, che viene incubata con un anticorpo primario. Dopo l’incubazione, l’anticorpo non legato è lavato via. In una ELISA diretta, l’anticorpo primario è direttamente coniugato ad un enzima (tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina), che può fendere un substrato cromogenico per produrre un cambiamento di colore visibile rilevato da uno strumento di rilevamento del segnale come un spettrofotometro15,16. Al contrario, se un anticorpo secondario enzima-collegata è usato per legare l’anticorpo primario, quindi questo è considerato come un’indiretta ELISA15,16. ELISA diretta è più velocemente mentre ELISA indiretto è più sensibile15,16. In un panino ELISA, le piastre sono rivestite con un anticorpo di “cattura” utilizzato per immobilizzare l’antigene di interesse nei campioni, e quindi l’antigene catturato può essere rilevato da un altro anticorpo di “rilevazione” in un modo diretto o indiretto15, 16. Sandwich ELISA offre alta specificità poiché l’antigene viene rilevato da due differenti anticorpi dell’antigene. In una ELISA competitivo, è istituita la competizione tra l’antigene del campione e l’antigene associato a piastra per il legame dell’anticorpo primario, e quindi alla concentrazione di antigene nel campione è quantificata misurando la riduzione del segnale dal substrato 15 , 16. ELISA competitivo può essere eseguita utilizzando il formato di diretto o indiretto di cui sopra ed è utile per la rilevazione degli antigeni piccoli con un solo epitopo15,16.

Tecniche alternative per la misurazione degli anticorpi comprendono radioimmunoanalisi (RIA), dosaggio elettrochemiluminescenza (ECL) analisi e superficie di risonanza plasmonica (SPR)17. RIA è stato il primo immunoassay sviluppato misure che la presenza di un antigene (o l’anticorpo) con elevata specificità e sensibilità usando reagenti radiomarcato18,19. Tuttavia, a causa delle preoccupazioni di tossicità radioattiva, i costi di smaltimento, shelf-life e licenze speciali per lavorare con materiali radioattivi, ELISA è una migliore e più conveniente tecnica comune utilizza20,21. ECL è un test altamente sensibile in cui reazioni chemiluminescenti sono avviate usando l’elettricità per generare specie altamente reattive da precursori stabili sulla superficie di un elettrodo e possono essere utilizzate per misurare la quantità di analiti (come antigeni o gli anticorpi)22. Tuttavia, ECL richiede uno strumento speciale e così non è usato nel senso più ampio come ELISA23. SPR è un dosaggio diretto che può essere utilizzato per misurare il grippaggio dei ligands (ad es., anticorpi) per immobilizzato molecole (ad es., antigeni) su un sensore chip superficie24. SPR rileva le interazioni in tempo reale in modo molto specifico e non richiede l’uso di reagenti etichettati come ELISA. Tuttavia, SPR inoltre richiede un’attrezzatura speciale e ha una sensibilità inferiore rispetto ELISA17. Date le limitazioni dei metodi alternativi, ELISA è la tecnica più adatta e conveniente per il nostro scopo in questo protocollo. Qui, descriviamo l’uso di sandwich ELISA per l’analisi dei livelli di isotipo Ig totali e le procedure di ELISA indiretto per l’analisi dell’antigene-specifiche Ig isotipi.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca animale istituzionale dell’Università di Rutgers. Tutti i topi sono utilizzati conformemente alle linee guida NIH e sotto un animale protocollo approvato dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale. 1. preparazione di topi e raccolta di sieri ingenuo Mouse Tenere tutti i topi per esperimenti di immunizzazione in uno specifico impianto privo di agente patogeno animale. Uso genere-abbinato, giova…

Representative Results

Abbiamo usato questo protocollo per indagare i ruoli di un critico regolatore del sistema immunitario, TRAF3, a TI e TD Ig isotipo risposte9,10,11. TRAF3 direttamente o indirettamente regola la trasduzione del segnale di un numero di recettori immuni innati e adattivi, tra cui la superfamiglia dei recettori del TNF, recettori Toll-like e T cell receptor/CD28, tra gli altri27</su…

Discussion

Qui, descriviamo il protocollo per la caratterizzazione delle risposte di isotipo TD e TI Ig in topi usando ELISA. Efficace attuazione del presente protocollo richiede l’uso di materiali specificati in tabella 1, compreso le piastre di dosaggio ELISA, immunizzazione Ags, mouse Ig specifici anticorpi e standard. Prestare la massima attenzione per evitare di utilizzare piastre di coltura del tessuto trattato per ELISA. Diluizioni degli standard e dei campioni di siero dovrebbero essere fatte in piastre sep…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzioni salute CA158402 R01 (P. Xie) e AI128264 R21 (P. Xie), il dipartimento della difesa concedere W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), un premio di pilota il Cancer Institute del New Jersey attraverso Grant numero P30CA072720 dal National Cancer Institute (P. Xie), una sovvenzione di biomedica Busch (P. Xie), una borsa di studio Stollar Victor (a. Levi) e un B. Anne e James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

Materials

VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2
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– Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)- Immunoglobulin (Ig) Isotype- Thymus-dependent- Thymus-independent- B Cell Activation- Germinal Center- TNP-polysaccharide- Retro-orbital Bleeding- Ig Isotype-specific Capturing Antibodies- TNP-38BSA Antigen- TNP-3BSA Antigen- Blocking Buffer- Ig Isotype Standard
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Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).
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