Beta-hücre işlevselliği tek hücreli çözünürlükte kalsiyum akını için genetik olarak kodlanmış bir muhabir kullanarak değerlendirilir kan şekeri homeostazı için önemlidir.
Pankreas beta hücreleri artan kan şekeri konsantrasyonları hormon insülin salgılayan tarafından yanıt. Beta hücre fonksiyon bozukluğu hiperglisemi ve ciddi, ölümcül sonuçlara yol açar. Beta hücreleri fizyolojik koşullar altında nasıl çalışır ve ne genetik ve çevresel faktörler onların disfonksiyon neden olabilir anlamak daha iyi tedavi seçenekleri Diyabetik hastalar için neden olabilir. Beta hücrelerinde kalsiyum düzeyleri ölçmek için yetenek kalsiyum iyonları Tetikleyicileri insülin yayın akını olarak beta-hücre işlevi önemli bir göstergesi olarak hizmet vermektedir. Burada tarif biz zebra balığı beta hücrelerinde glikoz uyarılmış kalsiyum akını GCaMP6s, kalsiyum genetik olarak kodlanmış bir sensör kullanarak izleme için bir iletişim kuralı. Yöntemi hücre içi kalsiyum dynamics ile monte edilmiş ex vivo adacıkları tek hücreli çözünürlükte izleme sağlar. Beta-hücre içinde aynı adacık glikoz yanıt aynı anda farklı glikoz konsantrasyonu altında zebra balığı beta-hücreleri arasında işlevsel heterojenite varlığı öneriyor yakalanabilir. Ayrıca, teknik kalsiyum akını glikoz stimülasyon üzerine salınım doğası ortaya yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğü sağlar. Yaklaşımımız zebra balığı beta hücre fonksiyonu ve fonksiyon bozukluğu için genetik ve çevresel faktörlerin katkı araştırmak için bir model olarak kullanmak için kapılarını açıyor.
Bizim kan şekeri endokrin pankreas işlev nedeniyle büyük ölçüde dar bir aralıkta tutulur. Endokrin pankreas rolünün hormon salgılayan hücreler içeren adacıkları of Langerhans tarafından gerçekleştirilir. İnsülin salgılayan beta-hücreleri karbonhidrat içeren bir yemek sonrasında kan şekeri düzeylerini azaltmak için sorumludur. Yetersiz insülin salgısı beta-hücre diyabet1sürekli yüksek kan şekeri ile karakterize, neden olabilir. Tip 1 ve tip 2 diyabet, şu anda 400 milyondan fazla insan dünya çapında afflicts, morbidite ve mortalite2için yol açar. Beta-hücre disfonksiyon katkıda moleküler ve çevresel faktörler inceleyerek, biz daha iyi nasıl tip 2 diyabet başlar ve devam eder anlamış oluruz. Buna ek olarak, insan kök hücreleri fonksiyonel beta-hücre vitro ayırt etmek için yetenek cep-yedek terapiler tip 1 diyabet için yeni beta-hücre bir kaynak sağlayabilir. Bu amaçla, çalışma beta hücre fonksiyonu ve olgunlaşma genetik model organizmalarda fonksiyonel beta-hücre içinde bir yemek yapmak için gerekli bilgi elde etmek için önemlidir.
Beta-hücre işlevselliği bütün adacık düzeyinde glikoz-stimülasyon karşılık olarak salgılanan insülin miktarı toplam miktarının tarafından izlenebilir. Bu toplu yaklaşım adacık hücreleri tek bir grup bir hücrenin bireysel özellikleri ayırt olmadan çalışmaları. Ancak, glikoz yanıt bireysel beta-hücre Analizi fonksiyonel özellikleri beta-hücre ve heterojenlik3varlığı bir çeşitlilik ortaya koydu. Işlev bireysel beta-hücre değerlendirmek için insülin salgısı4‘ e kurşun hücre içi değişiklikleri izlemek mümkündür. İnsülin salgılanması beta hücrelere glikoz girişlerin önce gelmelidir. Beta hücrelerinde girer glikoz ATP için hızla metabolize. Yüksek hücre içi ATP konsantrasyonları beta-hücre depolarizasyon için önde gelen ATP duyarlı potasyum iyon kanalları açık olasılığını azaltın. Depolarizasyon voltaj duyarlı kalsiyum iyon kanalları açılır ve hücre içi kalsiyum artar. Buna karşılık, kalsiyum ekzositozu insülin, dolaşımda piyasaya sürülen glikoz-kullanımı5,6,7teşvik ederek şekeri düşürür tetikler.
Işlev beta-hücre membran potansiyel8, insülin-veziküller ekzositozu9doğrudan görselleştirme ve miktar intrasellüler Ca+ 2 izleme dahil olmak üzere, araştırmak için uygulanan çeşitli stratejileri akın glikoz-yanıt verme hızını10için bir proxy gibi. Bunlar arasında yukarı ölçekleme-glikoz-yanıt arasında doğrudan karşılaştırma için izin aynı adacık11,12, birden fazla bireysel hücrenin analiz avantajı intrasellüler Ca2 + görüntüleme sağlar bireysel beta-hücre. İntrasellüler Ca2 + konsantrasyonu kalsiyum duyarlı floresan boyalar13 ya da genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (turk)14aracılığıyla izlenebilir. Oysa kalsiyum-gösterge boyalar olmaması hücre tipi özgüllük, Turk belirli hücre tipinde belirli rehberleri tarafından ifade edilebilir. Ayrıca, Turk, GCaMP6 gibi yeni nesil ile birlikte daha hızlı zamansal dinamiği15daha iyi sinyal-gürültü oranı sağlar. Burada biz yeni-nesil Turk, beta-hücreleri tek hücre çözünürlükte kalsiyum görselleştirmek için belirli GCaMP6s yardımcı programı tanımlamak. Zebra balığı birincil adacık seçim bizim model olarak bu yöntemi uygulamak. Embriyonik gelişim sırasında beta-birincil adacık hücrelerde sırt–dan kaynaklanan ve ventral pankreas16tomurcukları. Birincil adacık klişeleşmiş bir anatomik pozisyonda onun kolay tanımlanması ve yalıtım etkinleştirme zebra balığı pankreas içinde yer alır. Onların genetik ablasyon hiperglisemi17,–18yol açar gibi beta-birincil adacık hücrelerinde glikoz-yönetmelik için gereklidir. Ayrıca, bu beta hücreleri sırasında erken zebra balığı geliştirme19glikoz duyarlı olmak. Bu protokol sonrası embriyonik evrelerinde formu ikincil adacıkları Imaging’e da uygulanabilir. Protokol için görüntü beta hücreleri ex vivo, daha sonraki aşamalarında gelişme ve altında tanımlanmış glikoz konsantrasyonu sağlar.
Burada biz bir teknik beta-hücre glikoz yanıt tek hücreli çözünürlükte miktar için göstermek. Bu bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi, GCaMP6s kullanarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu izleyerek mümkün olmaktadır. Beta-hücre etkinliği yakalanan ex vivo yanında adacık fibrinojen-Trombin kalıp montaj olduğunu. Kritik bir iletişim kuralının kalıp kararlılığını adımdır. HBSS çözüm içinde çözülmeye fibrinojen için verilecek yeterli zamana ihtiyacı var. Bu olmadan, kalıp yeterince görüntüleme oturumu sırasında istikrar sağlamak için polimerize değil. Fibrinojen-Trombin kalıp içinde monte ve hücre kültür medyada dalmış bir adacık en az bir hafta (veri gösterilmez) canlı kalabilir. Fibrinojen-Trombin kalıp, düşük-melt özel gibi alternatifler adacık22takmak için yararlı olabilir. Başka bir kritik adacık diseksiyon parametresidir. Bu adım sırasında adacık çevreleyen doku yaralanmasına veya adacık alay olmadan kaldırılması gerekiyor. Usta bir diseksiyon uygulama ile geliyor.
Adacık bir confocal uçak için kısıtlama görüntüleme protokolü sınırlamasıdır. Bu bireysel beta-hücre içinde kalsiyum akını dinamikleri yakalamak için yapılır. Z yığınında adacık tüm kalınlığı düşük görüntüleme hızı ve tek tek hücreler salınım sinyal kaybına yol açar. Bu sınırlama 3-boyutlu kalsiyum dynamics yakalama etkinleştirmek için confocal-görüntüleme gibi dönen disk mikroskobu, daha hızlı yolları kullanarak gelişmiş olabilir. Başka bir sınır içinde vivo kalsiyum görüntüleme12olur. Zebra balığı embriyo şeffaf yapısı veya zebra balığı yetişkin23 suşları pigment daha az kullanımı gelecekte vivo içinde görüntüleme için olasılığını açılabilir.
Bireysel beta hücreleri arasında işlevsel heterojenite araştırmak için beta-hücre aktivitesi yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte görüntüleme sağlar. Bu yaklaşım beta-hücre alt nüfus varlığı ışık yardımcı olur. Son zamanlarda, birden fazla çalışmalar içinde sözde homojen beta-hücre24,25,26alt nüfus varlığını göstermiştir. Ex vivo görüntüleme genetik gazeteciler glikoz için alt halkın yanıtının karakterize için birleştirilebilir. Buna ek olarak, görüntüleme Kur farmakolojik stimülasyon ile birleştirerek beta-hücre işlevselliğini artırabilirsiniz bileşiklerin tarama için izin verebilirsiniz.
Özetle, burada sunulan tekniği miktar ve bireysel beta hücreleri glikoz yanıt karşılaştırmasını sağlar. Beta-hücre işlevselliği, diyabet gelişiminde önemli bir parametre içine doğrudan bir pencere sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Ninov laboratuvar Yorumlar için üyeleri üzerinde el yazması, Merkezi üyeleri rejeneratif terapiler Dresden (CRTD) balık ve mikroskopi tesisi için teknik yardım için teşekkür ediyoruz. N.N. DFG-CRTD, küme mükemmellik TU-Dresden, Alman Araştırma Vakfı (DFG) ve Alman merkezi diyabet araştırma (DZD) için fon tarafından desteklenir.
Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |