本协议描述了设计和执行多路化增强剂的步骤, 该方法与停用融合蛋白 SID4X-dCas9-KRAB (即增强器干扰) 相结合。该协议能够识别出调节基因表达的增强剂, 并促进调节共同靶基因的促促剂之间的关系的解剖。
多促进剂经常调节一个给定的基因, 但对于大多数基因, 它仍然不清楚哪些促进剂是必要的基因表达, 以及这些增强剂如何结合产生转录反应。随着数以百万计的促进剂被确定, 需要高通量的工具来确定增强功能的基因组范围。目前研究增强功能的方法包括使用核酸酶熟练的 Cas9 进行基因缺失, 但要研究多种促发剂的组合效应, 还是很难的, 因为多重连续克隆细胞系必须生成。在这里, 我们提出了一种基于 CRISPR 干涉的方法, 它允许在其内源位置同时对多个增强剂进行功能性审问。增强器-i 利用两个压制域融合到核酸酶缺乏 Cas9, SID 和 KRAB, 以实现增强失活通过组蛋白脱乙酰在靶位点。该协议利用导 rna 的瞬态转染, 使靶区的瞬态灭活, 尤其有效地阻断诱导转录反应的刺激在组织培养设置。增强剂-i 是高度特异的, 无论是在其基因组定位和它对全球基因表达的影响。从本协议获得的结果有助于了解增强剂是否有助于基因表达、贡献的大小, 以及其他附近促进剂对其贡献的影响。
大规模的排序项目 (如编码1、路线图 Epigenomics2和幽灵3 ) 在人类基因组中对数以百计的细胞类型进行了数以百万计的假定增强。据估计, 每一个启动子与平均4.9 促进剂, 每个增强剂接触平均2.4 基因3, 表明基因表达往往是多种分布式调节相互作用的综合结果。还有一个重要的挑战是, 不仅要定义个体增强剂如何促进基因表达, 而且还要确定它们是如何结合来影响表达的。遗传方法通常用于确定模型有机体中的增强剂与果蝇4到小鼠5之间的关系。然而, 这些实验是耗时和低吞吐量的研究多促进剂在多个基因。
研究增强函数的一种方法是大规模的并行报道。这些化验可以同时筛选数以千计的 DNA 序列, 使其能够驱动表达的记者基因6。虽然这些化验结果表明, DNA 序列可以单独足以传达基因调控信息7, 他们来与在本地染色质上下文之外和与异源启动子进行的警告。此外, 在大量平行报道中分析的 DNA 序列的大小通常少于 200 basepairs, 可能排除相关的周围序列。重要的是, 由于记者的化验只是一次测量一个序列的活动, 他们没有考虑到在促进剂之间可能存在的复杂关系。因此, 虽然大量平行的记者化验可以是关于 dna 序列的内在活动的信息, 但他们不一定告诉我们的功能, 该 dna 序列的范围内的基因组。
最近开发的 CRISPR/Cas9 工具8促进了基因调控的研究, 因为它们允许在内源轨迹中删除增强剂。然而, 同时删除多个增强剂可能会导致基因组不稳定, 并且在单个细胞线中生成连续的强化剂删除是很耗时的。此外, 在修复后的删除站点上创建了新的基因组序列, 这一序列可能获得调节功能。Cas9 的另一种版本是专门用于调制基因表达的, 依赖于激活9、10或抑制11、12域到核酸酶不足形式 Cas9 的融合。(dCas9)。这些融合蛋白是理想的同时研究多个基因座, 因为它们不会物理改变 DNA 序列, 而是调整表观遗传学, 以询问一个调控区域。最广泛使用的压制融合是 KRAB, 招募 KAP1 联合阻遏复合体, 促进抑制相关组蛋白 H3 赖氨酸 9 trimethylation (H3K9me3)13的沉积。dCas9-KRAB, 也称为 CRISPR 干扰14, 已被用于目标和屏幕上的个体增强剂为他们的贡献基因表达15,16;但是, 它还没有针对多个区域同时进行优化。一个版本的复用 CRISPR 干扰促进剂, 马赛克序列17, 使用单细胞 RNA 序列作为读数, 但这种技术是昂贵的, 只适合研究高表达基因由于低灵敏度的单细胞RNA-
我们试图开发一种基于 CRISPR 干涉的方法来解剖组合增强函数在雌激素转录反应的背景下。大约一半的雌激素应答基因含有2或更多的增强剂, 受雌激素受体α (ER) 附近的18的约束, 这表明多重促愈剂可能参与雌激素的反应, 理解调控逻辑需要同时瞄准多个增强剂。在启动器中使用 CRISPR 干扰的初步研究表明, 并非所有的启动子都同样响应 KRAB 介导的镇压19, 我们推断, 增加一个独特的压制域, 以 dCas9 可以促进失活多样的促进剂。我们选择了 Mad1 (SID)20的 Sin3a 交互域, 因为它导致了组蛋白乙酰21的招募, 这将移除与转录活动相关的组织蛋白上的乙酰基团。重要的是, SID 域在将基因表达式融合到 dCas922和故事23时是有效的, Sin3a 在各种增强程序序列上下文24中被证明是一个强有力的压制性的共同因素。我们使用 SID4x-dCas9-KRAB (增强剂 i) 靶向10种不同的促进剂绑定的 er, 并确定 er 结合点 (ERBS), 是必要的雌激素转录应答的4基因18。我们还瞄准了促进剂的组合, 以确定在雌激素转录应答的生产中合作的地点。我们发现, 多达50个站点可能同时具有可检测的基因表达变化的目标。利用芯片序列和 RNA 序列, 我们证明了增强剂 i 是一种高度特异的技术, 同时研究多促能器。
在本协议中, 我们描述了执行增强器 i 的步骤, 这是一种灵活的技术, 能够同时在组织培养环境中同时进行多种促进剂的功能研究。增强器-i 与基因删除高度相关, 但提供了依赖于组蛋白乙酰 (HDACs) 的瞬态失活。通过通过瞬变转染提供导 rna, 而不是通过病毒载体稳定集成, 该协议避免了 H3K9me3 的沉积和潜在扩散。本协议详细介绍了通过吉布森组装进行 RNA 的设计和克隆, 利用 lipofection 对导 rna 进行转染, 并通过 qPCR 对由此产生的基因表达变化进行分析。我们还包括评估增强剂的特异性的方法-i 靶向基因组和转录的水平。该技术是在人类癌细胞系中应用 ER 结合促进剂研究基因调控的同时, 适用于任何哺乳动物增强剂的解剖。
本协议描述了一种简单而灵活的方法来解剖增强函数在内源基因组轨迹没有物理改变 DNA 序列。虽然在概念上与以前发布的 CRISPR 干扰协议使用 dCas9-KRAB27相似, 但增强器-i 在3主要方式上与这些协议不同。首先, 增强器-i 利用 MAD120的 SIN3A 交互域来实现增强停用。利用 HDAC 抑制剂可以抢救增强剂失活, 提示失活的主要机制是 HDAC 依赖性的。不像 CRISPR 干扰 dCas9-KRAB, 增强剂-i 不导致沉积 H3K9me3。这很可能是由于增强剂-i 依赖于瞬态引入导 rna, 而细胞在转染后3天被收割。在 CRISPR 干扰中, H3K9me3 的增加在7天后转导12中观察到。最后, 增强 i 协议提供了一个针对多个站点同时同时监控目标效率的策略。在马赛克序列17中, dCas9-KRAB 用于同时针对多个增强剂, 但这种技术依靠单细胞 RNA 测序来识别表达变化, 许多基因 (如雌激素应答基因) 由于低单细胞 RNA-下增强因子的灵敏度-i 提供了一个可靠的方法来研究促进剂单独和组合为任何基因。
增强剂的最关键的步骤-i 是转染, 这应该是优化的细胞线的兴趣。该协议依赖于嘌呤霉素处理, 以丰富的转染细胞, 但有可能的联合转染引导 rna 与荧光蛋白和分类的荧光细胞使用流式细胞术可能被证明是一个更好的浓缩方法的一些细胞类型。我们建议通过 qPCR 来监测导 rna 和 SID4x-dCas9-KRAB 的表达水平, 以诊断和确认转染。如果指南 rna 水平低 (周期阈值 > 30), 用户也可以考虑其他指南 rna 生产策略, 如体外转录28。也有可能, 尽管高 gRNA 水平, 引导 rna 靶向 SID4x-dCas9-KRAB 蛋白是低效的, 在这种情况下选择不同的指南 rna 序列可能是必要的。通过对增强 i 治疗细胞的染色质对融合蛋白进行芯片序列处理, 可以对靶向的效率进行监测。如果在感兴趣的区域有 SID4x-dCas9-KRAB 的高信号, 并且没有发现其假设的目标基因的表达变化, 那么该区域在研究的条件下可能不会对该基因的表达做出贡献。
增强器的一个潜在限制是, 如果太多的站点同时被瞄准, 则非目标效果可能会累积。然而, CRISPR 干扰策略对于击倒的目标效果要比 rna29少, 特别是当使用多克隆细胞线表示 dCas9-KRAB 时。当我们同时瞄准10个地点时, 我们已经看到了 SID4X-dCas9-KRAB 的基因组结合, 我们没有确定基因表达的变化, 因为这些绑定事件。由于某些促进剂可能会接触到多个促进剂和/或其他促进剂, 有可能许多基因可能会改变表达后, 针对单一的增强剂, 虽然不清楚这种形式的基因调控是常见的。为了确认所观察到的表达式更改是由于针对特定的增强器, 而不是目标效果, 用户可以使用两组不同的非重叠导向 rna 来针对同一区域进行增强。此外, 利用核酸酶能力的 Cas9 对该区域的遗传缺失可以进一步证实其对基因表达的影响。
由于增强剂-i 功能通过组蛋白脱乙酰, 它是可能的, 其失活能力仅限于有明显水平的组蛋白乙酰化。有各种各样的替代性压制融合, 可能更有效地针对特定的增强剂。DNA 甲基融合到 dCas9 可以用来减少基因表达时, 针对远端促进剂30, 但这种镇压往往不是短暂的。另一个压制融合使用 GATA1 (FOG1) 域的朋友, 它导致组蛋白 H3 赖氨酸 27 trimethylation 和压抑基因表达的水平类似 dCas9-KRAB 跨各种细胞系和促进者31。有趣的是, 添加更多的 FOG1 到 dCas9 减少了启动器的压制潜力, 这表明 SID 域的一个副本可能提供更多的增强失活比目前使用的4拷贝在增强剂 i。在上述 dCas9 融合的不同组合中, 某些位点可能受益于双目标。例如, 可以通过同时转导 dCas9-DNMT3a 和 dCas9-KRAB32来实现稳定的长期压制。这些压制性融合大多只针对一个单一的轨迹, 在同一时间, 它仍然不清楚哪些是最有效地操作多个促进剂同时。
增强剂 i, 虽然一个适当的方法来研究促进者的组合, 少数基因, 仍然有点有限的吞吐量, 如果用户希望研究假定促增剂为数以百计的基因。这种技术的未来应用将结合成像技术, 同时在多个样本中量化多个基因。重要的是, 这些技术与从裂解液中直接检测 rna 分子是相容的, 消除了耗时的 rna 分离的需要。这些适应将有助于审讯更大的增强剂。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了 nih/NHGRI R00 HG006922 和 nih/NHGRI R01 HG008974 和猎人癌症研究所的支持。J.B.C. 在遗传学 T32GM007464 的 NIH 培训计划中得到了支持。
ZR 96-well Quick-RNA Kit | Zymo Research | R1053 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step | Applied Biosystems | 4389986 | |
AflII restriction enzyme | NEB | R0520S | |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531L | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | |
FuGENE HD | Promega | E2312 | |
DNA Clean & Concentrator Kit | Zymo Research | D4013 | |
Buffer RLT Plus | Qiagen | 1053393 | |
b-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | |
Human: Ishikawa cells | ECACC | 99040201 | |
H3K27ac rabbit polyclonal | Active Motif | 39133 | |
H3K9me3 rabbit polyclonal | Abcam | ab8898 | |
FLAG mouse monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
ER alpha rabbit polyclonal | Santa Cruz | sc-544 | |
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid | Addgene | 51133 | Shen et al., 2014 |
gRNA_cloningVector plasmid | Addgene | 41824 | Mali et al., 2013 |
AflII U6 puromycin plasmid | Addgene | 106404 | Carleton et al., 2017 |
SID4X-dCas9-KRAB plasmid | Addgene | 106399 | Carleton et al., 2017 |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads | Kapa Biosytems | KK8420 | |
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | ThermoFisher Scientific | A32959 | |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131035 | |
LB Broth | ThermoFisher Scientific | 10855001 | |
Quick-DNA Miniprep Kit | Zymo Research | D3020 | |
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder | NEB | N0050S |