בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה
Summary
אנו מציגים כיוונון של מלקחיים אופטיים מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון, ואת יישומו כדי לחקור מכניקה תא בלי חרוזים ב העובר דרוזופילה .
Abstract
מורפוגנזה דורשת תיאום בין המתבנת גנטי וכוחות מכני robustly לעצב את תאים ורקמות. ומכאן, אתגר להבין תהליכים morphogenetic הוא למדוד ישירות כוחות הסלולר לבין תכונות מכניות ויוו במהלך מופרה. כאן, אנו מציגים את כיוונון של מלקחיים אופטיים מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון, המאפשר ליישם ישירות כוחות על אנשי קשר תאים תאים של העובר דרוזופילה מוקדם, תוך כדי הדמיית במהירות של מספר פריימים לשניה. טכניקה זו יש יתרון כי הוא אינו דורש ההזרקה של חרוזים לתוך העובר, בדרך כלל נעשה שימוש הגששים ביניים שבו כוחות אופטי הם המופעל. אנחנו מפרטים שלב אחר שלב המימוש של ההתקנה, ולהציע כלים כדי לחלץ מידע מכני של הניסויים. על ידי ניטור של displacements של תא-תא אנשי הקשר בזמן אמת, אחד יכול לבצע מדידות מתח ולחקור rheology של אנשי הקשר של התא.
Introduction
התפתחות הוא תהליך מאוד לשחזור במהלכו תאים ורקמות לעוות לעצב את החיה לעתיד. דפורמציות כזה הוכחו דורשים הדור פעיל של כוחות ב ברמה1,תא2. כדי להבין תהליכים morphogenetic במהלכו תאים ורקמות לשנות את צורתם, לכן זה מפתח כדי להעריך את התכונות המכאניות של התאים המעורבים, וכדי למדוד את הכוחות בתוך רקמת במהלך תהליך3,4 . שכבות אפיתל, בפרט דרוזופילה, נחקרו באופן נרחב עקב הגיאומטריה קוואזי-2D שלהם וכדי שלהם טיפול קל.
מספר טכניקות ולכן פותחו על ידי, ואחרים כדי להעריך מכניקה אפיתל ויוו במהלך הפיתוח. אני אתן סקירה מהירה של שלושת הטכניקות העיקריות בשימוש ברקמות האפיתל. אבלציה לייזר, שיטה בשימוש נרחב, מאפשרת לחשוף את הלחץ מכני מקומי ברמת התא צמתי5,6,7,8 או גדולים בקנה מידה9,10,11 על-ידי ביצוע חתכים המקומי לשבש את תקינות מכנית של המטרה. הדינמיקה של הפתח בעקבות החתך מספק מידע על אבלציה מוקדמת מתח, וגם על rheology של12,רקמת13. החיסרון של אבלציה לייזר היא שזה פולשני, כפי שהוא דורש שיבוש קליפת תא מקומיים. לפיכך, אחת ניתן לבצע רק מספר מוגבל של ablations אם אדם רוצה לשמר את שלמות רקמות. חיסרון נוסף הוא כי ablations מספקים רק הערכות היחסי של מתח התא באנשי קשר, מאז פתיחת המהירות תלויה חיכוך צמיגה, אשר בדרך כלל אינו ידוע. מניפולציה מגנטי גם פותחה, בשימוש דרוזופילה, המערבים את השימוש ferrofluids14 או ליפוזומים ultramagnetic15. הם יכולים לספק מדידות מוחלטת16,17, אבל הם גם פולשני במובן שהן דורשות ההזרקה של הגששים-המיקום הרצוי. זה יכול להיות מסובך מאוד תלוי במערכת, וזה לא תמיד לבצע זריקות מדויקות. טכניקה שלישית, לחלוטין לא פולשנית, היא כוח היסק18,19,20. כוח היסק מסתמך על ההנחה של שיווי משקל מכני בנקודות טריפל (tricellular צמתים או קודקודים), מאפשר להסיק המתחים בכלל תא-תא אנשי קשר (ואולי, לחצים בכל תאי) על ידי פתירת בעיית ההופכי. מתחים, כל קודקוד מספק שתי משוואות (X ו- Y). זה מניב מערכת גדולה של משוואות לינאריות, אשר יכולה להיות הפוכה בתנאים מסוימים כדי להעריך את המתח על כל אנשי הקשר של התא. אמנם שיטה זו מושכת מאוד, כפי שהיא דורשת רק תמונה מקוטעת, לא ניסוי נוסף או את תוכנית ההתקנה, רמת הדיוק שלה היא עדיין לקבוע, שוב זה רק מספק ערכים יחסיים, אלא אם כן מתבצעת מדידה כיול מוחלטת.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, נסקור במאמר זה כיוונון של פינצטה אופטית מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון להחלת כוחות מבוקרת המידה תא ב האפיתל מתחלקים של melanogaster דרוזופילה. מלקחיים אופטיים שימשו עבור יישומים ביולוגיים רבים, כולל את המידות על חלבונים יחיד ומניפולציה של organelles ותאים21. כאן, אנחנו מדווחים כוחות יישומית בטווח של כמה עשרות pN, אשר קטן עדיין מספיק כדי לגרום העיוותים המקומיים אנשי תא ולבצע מדידות מכניות ויוו. בדרך כלל, אנו משתמשים הסטה אנכית של אנשי קשר תא, פיקוח באמצעות הניתוח של kymographs, להתייחס כוח דפורמציה. חשוב, ההתקנה שלנו לא דורשת ההזרקה של החרוזים על המיקום הרצוי בתוך הרקמה, כפי מלקחיים אופטיים מסוגלים להפעיל כוחות על התא-תא אנשי קשר ישירות. זיווג מלקחיים אופטיים כדי מיקרוסקופ אור גיליון מאפשרת לבצע הדמיה מהירה (מספר פריימים לשניה), וזה ניכר מאוד עבור ניתוח מכני-פרקי זמן קצרים, ועם phototoxicity מופחת, מאז איור מדגם הוא מוגבל למישור הדמיה22.
פינצטה אופטית, הכולל, הם דרך לא פולשנית כדי להחיל כוחות מבוקרת תא באנשי קשר ויוו ב העובר דרוזופילה , וכדי לחלץ מידע מכני כגון נוקשות ועל מתח התא אנשי קשר23, מאפייני rheological 24, ואת הדרגה או מתח23. בנוגע למקורו.
Protocol
Representative Results
Discussion
מלקחיים אופטיים מאפשרים לבצע מדידות מכניות מוחלטת ישירות בתוך האפיתל מתחלקים המתפתח בצורה לא פולשנית. במובן הזה, הוא מציג יתרונות על פני שיטות אחרות כגון אבלציה לייזר, אשר הינם פולשניים, לספק יחסי מדידות, כוחות מגנטיים, אשר דורשים זריקות, או להכריח היסק, אשר נשענת על הנחות חזק גם לספק יחסי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי עקרות Equipe גרנט עקרות DEQ20130326509, סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש גרנט ANR-בלאן, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (ל פ-F.L.). אנו להכיר תשתית צרפת-BioImaging הנתמכים על ידי הצרפתי הלאומי לחקר הסוכנות (ANR-10-INBS-04-01, «השקעות לעתיד»). אנו מודים Brice Detailleur ו קלוד מורטי מן התשתית PICSL-בי-איי לקבלת סיוע טכני.
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
References
- Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
- Heisenberg, C. -. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), 186-196 (2016).
- Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
- Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
- Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
- Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
- Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Mitrossilis, D., Röper, J. -. C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
- Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
- Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
- Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
- Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
- Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
- Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
- Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
- Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
- Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).
