Производство и визуализация бактериальный Spheroplasts и протопласта характеризуют антимикробного пептида локализации
Summary
Здесь мы представляем протокол производить грамотрицательные Escherichia coli (E. coli) spheroplasts и грамотрицательных Bacillus megaterium (B. megaterium) протопласта четко визуализировать и быстро характеризуют пептид бактерии взаимодействий. Это обеспечивает систематический метод для определения мембраны локализации и translocating пептидов.
Abstract
Использование confocal микроскопии в качестве метода для оценки пептид локализации шаблонов внутри бактерии обычно препятствует резолюции пределы обычных легких микроскопы. Как разрешение для данного Микроскоп невозможно укрепить легко, мы представляем протоколы для преобразования небольшой палочковидные грамотрицательные Escherichia coli (E. coli) и грамотрицательных Bacillus megaterium (B. megaterium) в больших, легко фотосъемка сферической формы называют spheroplasts или протопласта. Это преобразование позволяет наблюдателям быстро и четко определить пептиды подать себя в бактериальной мембраны (то есть, мембраны локализации) или крест мембраны войти в камеру (например, translocating). С этим подходом мы также представляем систематический метод характеризовать пептидов как мембрана локализации или translocating. Хотя этот метод может быть использован для различных мембраны активных пептидов и бактериальных штаммов, мы продемонстрировать полезность настоящего Протокола путем наблюдать взаимодействие Buforin II P11A (BF2 P11A), антимикробного пептида (AMP), с E. coli Spheroplasts и B. megaterium протопласта.
Introduction
Антимикробных пептидов (AMPs) получили внимание из-за их потенциального использования в качестве альтернатив обычные антибиотики1,2,3,4,5. Translocating через клеточную мембрану и взаимодействующих с внутриклеточных компонентов, таких как нуклеиновые кислоты или на permeabilizing мембрану, причиной утечки содержимого ячейки6ампер убивают бактерии. В дополнение к их использования как антибиотики translocating усилители могут быть адаптированы для доставки приложений наркотиков потому, что они могут-непредвиденное крест непроницаемой клеточной мембраны7,8. Мы, таким образом, стремятся понять фундаментальные AMP механизмы действий, чтобы заложить основы для их использования в конструкции снадобья.
Конфокальная микроскопия предлагает способ оценки локализации шаблонов дневно обозначенные усилителей в бактериальных клетках, обеспечивая понимание их механизм действий9,10,,11,12, 13 , 14. путем маркировки мембраны бактерий, можно определить, если дневно обозначенные пептид локализует мембраны или пространство внутриклеточных бактериальных клеток. Однако этот метод ограничен небольшой размер и стержня формы бактерий, которые могут сделать визуализации сложной из-за пределы резолюции обычных легких микроскопов и переменной ориентации бактерии на слайд15.
Цель представленных метода является возможность расширения визуализации дневно обозначенные пептид локализации шаблонов с помощью конфокальной микроскопии. Визуализация является расширение, превратив маленький, тонкий, палочковидные грамотрицательные Escherichia coli (E. coli) и грамотрицательных Bacillus megaterium (B. megaterium) бактерий в расширенном, сферической формы, именуемый Spheroplasts (для грамотрицательных штаммов) и протопласта (для грамположительных штаммов)16,17,18,19,,2021. Spheroplasts и протопласта легче изображения из-за их увеличение размера и их симметричная форма, которая делает ориентации бактерии на слайде значения для своих изображений. Кроме того мы представляем систематический подход к количественно анализа данных confocal микроскопии для того чтобы характеризовать AMPs как либо мембраны, локализация или translocating. Применение этих методов делает его легче отличить дневно помечены пептид локализации шаблонов. Протоколы, представленные здесь может использоваться для оценки локализации разнообразных мембраны активных агентов помимо усилителей, включая пептиды, проникая в клетки.
Преимущество этой техники является, что он обеспечивает понимание механизма действия усилителей на уровне одной ячейки, который может выявить гетерогенности клеток в15, в отличие от других анализов флуоресценции, обычно используется для идентификации механизмы действия усилителей, которые обеспечивают только массовой оценки9,22,23,24,25. Использование spheroplasts и протопласта для того чтобы оценить AMP запись ячейки является особенно полезным26 потому, что они являются более физиологически соответствующих15 чем другие модели, используемые для оценки записи ячейки, например липидов везикулы24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протоколы, представленные здесь сделать возможным для исследователей более быстро получить более крупные выборки бактериальных изображений, потому что увеличены, сферические бактерии являются гораздо проще найти, ориентации и изображения. Это расширение возможностей для сбора данн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддержка исследования осуществлялась в национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (низ-NIAID) премии R15AI079685.
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
- Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
- Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
- Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
- Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
- Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
- Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
- Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -. M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
- Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
- Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
- Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
- Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
- Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
- Park, C. B., Yi, K. -. S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
- Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
- Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
- Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
- Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
- Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
- Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
- Nadeau, J. L. . Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , (2016).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
- Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
- Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. 생화학. 43 (49), 15610-15616 (2004).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
- van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
- Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
- Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
- Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
- Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
- Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
- Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).
