उत्पादन और बैक्टीरियल Spheroplasts और Protoplasts के दृश्य रोगाणुरोधी पेप्टाइड स्थानीयकरण की विशेषता के लिए
Summary
यहां हम एक के लिए ग्राम-नकारात्मक ई कोलाई (ई. कोलाई) spheroplasts और ग्राम पॉजिटिव बैसिलस megaterium (बी. megaterium) protoplasts स्पष्ट रूप से कल्पना और तेजी से विशेषता का उत्पादन प्रोटोकॉल मौजूद पेप्टाइड-बैक्टीरिया बातचीत । यह झिल्ली स्थानीयकरण और translocating पेप्टाइड्स को परिभाषित करने के लिए एक व्यवस्थित विधि प्रदान करता है ।
Abstract
एक विधि के रूप में फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग बैक्टीरिया के भीतर पेप्टाइड स्थानीयकरण पैटर्न का आकलन करने के लिए आमतौर पर पारंपरिक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के संकल्प सीमा से हिचकती है । के रूप में दिया माइक्रोस्कोप के लिए संकल्प आसानी से बढ़ाया नहीं जा सकता है, हम वर्तमान प्रोटोकॉल छोटे रॉड के आकार का ग्राम नकारात्मक ई कोलाई (ई. कोलाई) और ग्राम पॉजिटिव बैसिलस megaterium (बी. megaterium) को बदलने के लिए बड़े में, आसानी से spheroplasts या protoplasts नामक गोलाकार रूपों छवि । यह परिवर्तन पर्यवेक्षकों तेजी से और स्पष्ट रूप से निर्धारित करें कि क्या पेप्टाइड्स खुद को बैक्टीरियल झिल्ली में दर्ज की अनुमति देता है (यानी, झिल्ली स्थानीयकरण) या झिल्ली पार करने के लिए सेल (यानी, translocating) दर्ज करें । इस दृष्टिकोण के साथ, हम भी एक व्यवस्थित करने के लिए पेप्टाइड्स झिल्ली स्थानीयकरण या translocating के रूप में विशेषता विधि प्रस्तुत करते हैं । हालांकि इस विधि झिल्ली सक्रिय पेप्टाइड्स और जीवाणु उपभेदों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हम Buforin द्वितीय P11A (BF2 P11A), एक रोगाणुरोधी पेप्टाइड (AMP), ई. कोलाई के साथ की बातचीत देख कर इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता प्रदर्शित spheroplasts व megaterium protoplasts.
Introduction
रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (AMPs) पारंपरिक एंटीबायोटिक दवाओं के लिए विकल्प के रूप में उनकी क्षमता का उपयोग करने के कारण ध्यान प्राप्त किया है1,2,3,4,5. AMPs या तो सेल झिल्ली भर में translocating द्वारा बैक्टीरिया को मारने और न्यूक्लिक एसिड के रूप में intracellular घटकों के साथ बातचीत या permeabilizing द्वारा कोशिका सामग्री के रिसाव के कारण झिल्ली6. वे गैर disruptively अभेद्य कोशिका झिल्ली7,8पार कर सकते हैं क्योंकि एंटीबायोटिक दवाओं के रूप में उनके उपयोग के अलावा, translocating AMPs दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम, इसलिए, कार्रवाई की मौलिक AMP तंत्र को समझने के लिए दवा डिजाइन में उनके उपयोग के लिए नींव रखना चाहते हैं ।
फोकल माइक्रोस्कोपी कार्रवाई के अपने तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के जीवाणु कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट लेबल AMPs के स्थानीयकरण पैटर्न का आकलन करने के लिए एक रास्ता प्रदान करता है9,10,11,12, 13 , 14. बैक्टीरिया की झिल्ली लेबल द्वारा, एक अगर एक फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड झिल्ली या एक जीवाणु कोशिका के intracellular अंतरिक्ष के लिए स्थानीयकरण निर्धारित कर सकते हैं । हालांकि, इस तकनीक छोटे आकार और बैक्टीरिया के रॉड आकार द्वारा सीमित है, जो इमेजिंग पारंपरिक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के संकल्प सीमा और स्लाइड15पर बैक्टीरिया के चर अभिविन्यास के कारण चुनौतीपूर्ण बना सकते हैं ।
प्रस्तुत विधि के लक्ष्य को फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड स्थानीयकरण पैटर्न का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोपी के बढ़ाया दृश्य सक्षम है । दृश्य छोटे, पतले, रॉड के आकार का ग्राम-नकारात्मक ई कोलाई (ई. कोलाई) और ग्राम पॉजिटिव बैसिलस megaterium (बी. megaterium) जीवाणु बढ़े, गोलाकार रूपों के रूप में निर्दिष्ट मोड़ से बढ़ाया है spheroplasts (ग्राम-अनिष्ट उपभेदों के लिए) तथा protoplasts (ग्राम-धनात्मक उपभेदों के लिए)१६,१७,१८,१९,२०,२१. Spheroplasts और protoplasts दोनों अपने आकार और उनके सममित आकार है, जो अपनी इमेजिंग के लिए अप्रासंगिक स्लाइड पर एक जीवाणु के उंमुखीकरण बनाता है की वजह से छवि के लिए आसान कर रहे हैं । इसके अलावा, हम एक व्यवस्थित दृष्टिकोण को मात्रात्मक विश्लेषण फोकल माइक्रोस्कोपी डेटा के क्रम में या तो झिल्ली स्थानीयकरण या translocating के रूप में AMPs विशेषताएं प्रस्तुत करते हैं । इन तरीकों को लागू करना आसान फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड स्थानीयकरण पैटर्न भेद करने के लिए बनाता है । यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक किस्म की झिल्ली के स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-सक्रिय एजेंट AMPs के अलावा अन्य, सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स सहित.
इस तकनीक का एक अलग लाभ यह है कि यह एक एकल कोशिका स्तर पर AMPs की कार्रवाई के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जो सेल के लिए सेल विविधता15प्रकट कर सकते हैं, के रूप में अंय प्रतिदीप्ति सामांयतः की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया परख के खिलाफ AMPs, जो केवल थोक अनुमान प्रदान की कार्रवाई के तंत्र9,22,23,24,25. spheroplasts और protoplasts के उपयोग के क्रम में AMP सेल प्रविष्टि का आकलन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है26 क्योंकि वे अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है15 अंय मॉडलों की तुलना में ऐसे लिपिड बुलबुले24के रूप में सेल का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल और अधिक तेजी से जीवाणु छवियों का बड़ा नमूना आकार प्राप्त करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए यह संभव बनाने के लिए, क्योंकि बढ़े, गोलाकार बैक्टीरिया बहुत खोजने के लिए आसान कर रहे हैं, ओ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
शोध को राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान (NIH-NIAID) पुरस्कार R15AI079685 द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
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