Summary
Aquí presentamos un protocolo para el uso de vasos O formado, especializados para cultivos de suspensión de agregados celulares, con agitación orbital. Las células HEK293 crecidas en esta bolsa de forman más homogéneas agregados que los cultivados en recipientes de cultivo convencional.
Abstract
Culturas de la suspensión de los agregados de células de mamífero se requieren para diversas aplicaciones en los campos médicos y biotecnológicos. El método basado en la bolsa desechable es una de las técnicas más simples para la producción en masa de agregados celulares, pero no protege los cultivos contra la agregación excesiva, que ocurre cuando se reúnen en el centro inferior de la vasija de la cultura. Para resolver este problema, hemos desarrollado un plato en forma de O y un bolso en forma de O, ninguno de los cuales contiene una región central. Agregados en cualquier embarcación formada O de la cultura eran perceptiblemente más uniformes en tamaño que agregados en buques convencionales. Análisis histológicos demostrados que agregados en platos de cultivo convencionales contienen núcleos necróticos muy probablemente causadas por un suministro deficiente de oxígeno. Por el contrario, agregados que fueron cultivadas en la bolsa en forma de O, incluso aquellas con diámetros similares a los agregados en platos de cultivo convencionales, no presentaron núcleos necróticos. Estos resultados sugieren que la bolsa en forma de O proporciona suficiente oxígeno a los agregados debido a la permeabilidad al oxígeno del material de la bolsa. Por lo tanto, proponemos que este bolso de novela permeable al gas en forma de O cultura es conveniente para la producción en masa de agregados uniforme que son necesarias en distintos campos biotecnológicos.
Introduction
Cultivo de suspensión celular desempeña un papel importante en la producción de células para la medicina regenerativa1 y recombinante proteína producción2 porque es fácil de escalar y alcanzar densidades de célula alta, a veces hasta más de 107 células / mL5. 3 de células de ovario de hámster chino (CHO) y riñón embrionario humano células 293 (HEK293)4 se han cultivado en la cultura de la suspensión, y las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) recientemente se han cultivado en sistemas de cultivo de suspensión para regenerativa terapias1,6,7. El uso de las culturas de la suspensión se espera que aumente en el futuro.
En la cultura de suspensión, algunas líneas de células no pueden crecer como células individuales y por lo tanto, deben formar agregados. Por ejemplo, hPSCs no puede sobrevivir en las condiciones de la suspensión sin formar agregados. Sin embargo, este requisito para el crecimiento de agregados presenta dificultades para las culturas de la suspensión uniforme. Una dificultad es la formación de agregados uniforme en el período temprano de la cultura, que determina la eficacia de la suspensión la cultura8. Otra dificultad es la transferencia de masa de nutrientes en agregados. En particular, el suministro de oxígeno limita el tamaño máximo de agregados, y un suministro deficiente de oxígeno causa necrosis en el centro de agregados9. Por lo tanto, culturas de la suspensión de agregados de células son más difíciles de obtener que las culturas de la suspensión convencional. Sin embargo, las culturas de la suspensión son cruciales para biomédica y aplicaciones de la biotecnología.
Recipientes de agitación orbitales están uno de los más simples sistemas de cultivo de suspensión que lograr mezclas de medio de cultivo sin agitación impulsor. Tensión de esquileo de la hélice y el flujo medio dinámico es el principal problema de la cultura de suspensión porque causa daño celular y diferenciación. Para lograr la agitación con una menor tensión de esquileo, investigadores e industrias han desarrollado una variedad de agitación orbital buque sistemas2,10.
Sin embargo, los recipientes de cultivo convencionales no están diseñados para orbital sacudiendo las culturas. En orbital sacudiendo los vasos, las células gravitan hacia el centro inferior de los vasos por un tipo de flujo medio conocido como la "paradoja de la hoja del té de Einstein"11, que causa la agregación no homogénea de las células. El flujo circular, causado por una fuerza centrífuga y la fricción entre el medio de cultivo y un vaso, barre las células en el centro11,12. Además, bolsas de cultivo convencionales para la cultura de masas son en forma de cuadrado, que no es conveniente para agitación orbital.
En este estudio, hemos desarrollado una bolsa nueva cultura adecuada para orbital sacudiendo las culturas. La novedad de esta bolsa es su forma O que no tiene una región de centro, por lo que las células se impiden la reunión en la región de centro de la parte inferior. También hemos demostrado el manejo de estas embarcaciones con una cultura HEK293 para demostrar la posibilidad de estas bolsas para aplicaciones biotecnológicas.
Protocol
1. preparación de las células y materiales
- Cultivar células HEK293 en medio de Eagle modificado de Dulbecco con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y los de aminoácidos no esenciales 1%. Ajustar el pH del medio de cultivo a 6.8 7.6.
- Después de cultivo de 5 a 7 d, disociar las células con una solución de ácido etilendiaminotetraacético tripsina de 0.25% (tripsina-EDTA) y contaminar las células en 5.000-10.000 células/cm2.
2. siembra de las células en un bolso en forma de O
- Disociar las células como se describe en el paso 1.2 y resuspender en 2-5 mL de medio de cultivo.
- Filtrar la suspensión de células a través de un tamiz celular (40 μm) para recoger una suspensión unicelular.
- Contar el número de células por tinción trypan azul y contador celular automático y luego preparar 20 mL de la suspensión celular (2.0 x 105 células/mL).
- Conecte la entrada de la bolsa en forma de O (Figura 1a) con una jeringa de 50 mL está sin un émbolo.
Figura 1: esquema imágenes y fotografías de los vasos en forma de O. (a1) Esta es una imagen esquemática de un bolso en forma de O. (a2) Esta es una fotografía de un bolso en forma de O. (b1) Esta es una imagen esquemática de un plato en forma de O. (b2) Esta es una fotografía de un plato en forma de O. El diámetro externo e interno de la bolsa en forma de O son 90 mm y 20 mm, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Pipetear la suspensión preparada en la bolsa en forma de O a través de la jeringa sujetada.
- Vuelva a colocar la primer jeringa sujetada con una jeringa limpia. Agregar 55 mL de aire limpio a través de la jeringa limpia para ampliar la bolsa completamente.
- Sujete el tubo de entrada y cierre la entrada. Finalmente, quite la abrazadera del tubo.
- Incubar las células en la bolsa en forma de O por agitación en 45 rpm en condiciones de 37 ° C y 5% CO2.
3. medio cambio (opcional)
- Transfiera la suspensión de células en un tubo de 50 mL a través de la entrada.
- Centrifugar durante 2 min a 200 x g a temperatura ambiente y luego aspirar el sobrenadante.
- Añadir 20 mL de medio de cultivo y resuspender las células.
- Las células resuspendidas para agregar a la bolsa en forma de O siguientes pasos 2.4-2.7.
- Incubar las células en la bolsa en forma de O por agitación en 45 rpm en condiciones de 37 ° C y 5% CO2.
4. recolección de las células de la bolsa
- Transfiera la suspensión de células en un tubo de 50 mL a través de la entrada.
- Lavar el interior de la bolsa con 20 mL de tampón de fosfato libre de calcio/magnesio solución salina [PBS(-), pH = 7.4-7.6] y luego vaciar el contenido en un tubo para recoger las células restantes de la bolsa.
- Centrifugar la suspensión celular recogida por 3 min a 200 x g a temperatura ambiente y luego aspirar el sobrenadante.
- Añadir 10 mL de PBS(-) y lavarse los agregados.
- Centrifugar por 3 minutos a 200 x g a temperatura ambiente y luego aspirar el sobrenadante para recoger los agregados.
- Añadir 4 mL de PBS y 1 mL de tripsina e incubar con los agregados por 10 min a 37 ° C para disociar las células para contar (opcional).
5. preparación de un plato en forma de O (opcional)
Nota: Ver Figura 1b para una imagen esquemática del plato en forma de O.
- Cortar la parte inferior de un plato de 60 mm o 35 mm con un cuchillo caliente y utilizar como una fuente de interior.
- Ponga el plato 60 mm boca abajo en el centro de un plato de 100 mm.
Nota: Una hoja de guía puede ayudar a decidir la posición del plato 60 mm. - Si es necesario, poner ciclohexanona ajustar viscosidad de la comisura desde el interior del plato 60 mm.
- El plato en forma de O en seco durante unos días y esterilización por rayos gamma o etileno gas de óxido.
Representative Results
Según nuestras mediciones, agregados en el plato convencional habían variado diámetro después de 5 d de agitación orbital. En contraste, agregados en vasos en forma de O para d 5 tuvieron diámetros uniforme mucho más. La cultura convencional plato demostró pequeños agregados (50-200 μm), mientras que las culturas de los vasos en forma de O no contiene cualquier pequeños agregados (Figura 2a). Según la medida de tamaño de imagen, la cultura de plato convencional mostró dos picos diferentes (figura 2b1), indicando una amplia desviación de tamaño agregado. Este resultado implica que los agregados en el plato convencional fueron creciendo bajo dos condiciones diferentes en la misma cultura, que podría resultar en calidad celular heterogéneo. Por otro lado, agregados en vasos en forma de O demostrados un solo pico y menos desviación de diámetro que en el plato convencional (figura 2b2 y 2b3), sugiriendo que tales agregados pueden ser de una calidad más uniforme.
Figura 2: diámetros de agregados en varios recipientes y morfologías. Estos paneles muestran (a) imágenes de brightfield y (b) histogramas de agregados crecidos (a1 y b1) un convencional plato (a2 y b2) una O en forma de plato, o (a3 y b3) un bolso en forma de O. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Hematoxilina y eosina de agregado cortes transversales demostraron que agregados en el plato convencional tenían algunas células denucleated y núcleos necróticos (figura 3a). Sin embargo, agregados en vasos en forma de O no mostró ningún corazones necróticos (figura 3b y 3C). En particular, en la bolsa O en forma de agregados eran tan grandes como ésos en el plato convencional pero no tenía ningún corazones necróticos (Figura 3C). Estos resultados sugirieron que la bolsa permeable al gas había suministrado oxígeno suficiente a la cultura.
Figura 3: cortes transversales de agregados en recipientes diferentes. Las secciones son 12 μm de espesor y fueron preparadas de muestras congeladas. Las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina para visualizar las células. (a) la celda agregados crecida en una cultura de suspensión convencional demostró núcleos necróticos. Agregados de células cultivadas en cualquiera de los dos (b) un plato en forma de O o (c) un bolso en forma de O demostraron muy poca necrosis en sus corazones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Recuentos de células demostraron que más del 85% de las células sobrevivieron durante 5 d de la cultura de suspensión en cada recipiente (figura 4a). La densidad celular final fue aproximadamente de 1.5-2.0 x 106 células/mL. Aunque no hubo ninguna diferencia significativa, la proporción de crecimiento en la bolsa en forma de O fue mayor que en otros recipientes (Figura 4b). Las tasas de crecimiento de las células en el plato convencional, el plato en forma de O y la bolsa en forma de O entre el día 2 y día 5 fueron de 0,018 y 0,025 0,020 h-1, respectivamente.
Figura 4: viabilidad y crecimiento de la célula. Estos paneles muestran la (una) célula viabilidad y (b) densidad celular de las células HEK293 en diferentes recipientes de cultivo después de 2 d de la cultura (día 2) y 5 d de la cultura (día 5). Los valores representan la media de los resultados de 3 experimentos independientes. Se calcularon los valores para cada experimento de células teñidas de azul tripán contadas con un contador celular automático. Las barras de error indican la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1: distribución en 2 formatos diferentes plato en varias condiciones de agitación del grano. Este panel muestra la distribución de grano durante varias condiciones de agitación (30, 40 y 45 rpm) en un plato convencional y en forma de O. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
En este estudio, desarrollaron naves en forma de O y realizar una cultura de suspensión HEK293 en ellos para una formación de agregados uniforme y expansión. En la placa de cultivo convencional, un orbital sacudiendo cultura produjo dos diversos diámetros de agregados, mientras que se observaron agregados uniforme en los vasos en forma de O (figura 1). Según la observación de la distribución de granos manchados en las condiciones de agitación orbitales, los granos se reúnen en el centro inferior de una placa de cultivo convencional. Esa reunión había causado probablemente la diferencia en la densidad celular a diferentes tamaños de agregados. Alternativamente, los granos fueron distribuidos en el plato en forma de O que no tiene la región centro-inferior (suplementario Figura 1). Probablemente esta distribución hace que los agregados de tamaño uniforme en vasos en forma de O. Otro — ampliamente utilizado: enfoque a la producción de agregados uniforme es el cultivo en los micropocillos, pero este enfoque tiene algunos problemas, como en el suministro de un medio de cultivo sin agregados que cae fuera de los micropocillos13. En el caso de los recipientes en forma de O, se pueden producir agregados uniforme en una cultura de suspensión simple.
El orbital sacudiendo la cultura es un sistema de cultura popular utilizado para células de mamífero. Hay varios métodos de cultivo para la producción masiva de células de mamíferos, como el depósito de agitación biorreactor14, bolsas movió la onda15y botellas. Culturas de agitación orbitales no incluyen un rotor interno para agitar el medio, a diferencia del de tanque agitado hace un biorreactor. Esta función es similar a la onda movió bolsas y botellas giratorios. Estos sistemas de cultivo libre de impulsor pueden evitar el daño celular de la fuerza de esquileo que rodean los impulsores y realizar bajo tensión de esquileo en la cultura de la suspensión. Sobre todo, sistemas de cultivo agitación orbital son eficaces para la producción masiva de células sensibles tales como células de mamíferos debido a su alta escalabilidad y bajo tensión de esquileo.
Los vasos en forma de O pueden mejorar el problema que queda de la cultura agitación orbital en la formación de agregados. En orbital sacudiendo los sistemas de cultivo, las células flotantes emigran al centro y fondo del recipiente, que se conoce como la "paradoja de la hoja del té de Einstein"11. Esta migración provoca la agregación no homogénea y la producción agregada no uniforme en orbital convencional sacudiendo los vasos. En este estudio, los vasos en forma de O evitar la concentración de células en el centro de fondo de los vasos, que se especula como la razón de uniforme agregación en vasos de forma O agitación orbitales.
Análisis histológicos demostraron que los agregados en el plato convencional contuvieron las células denucleated (Figura 2a). En contraste, las células denucleated no aparece en los agregados de los recipientes en forma de O (figura 2b y 2C). Es posible que estas células denucleated fueron causadas por la escasez de sustratos como la glucosa, glutamina y oxígeno9. Según la medición del tamaño, agregados en los vasos en forma de O tenían homogéneos diámetros inferiores a 400 μm. En cambio, en una fuente convencional, algunos agregados tenían un diámetro superior a 400 μm, y estos agregados incluyen las células denucleated. Este resultado sugiere que la creación de agregados de tamaño homogéneo en vasos en forma de O es eficaz en el control de la calidad de los agregados. Además, también se especula que la oxigenación a través de la película de polietileno gas-permeables prevenir la aparición de células denucleated en la bolsa en forma de O.
Estos experimentos demostraron la posibilidad de estos vasos en forma de O como un sistema simple para la producción de agregados uniforme. Aunque otros bolsos de la cultura para la cultura de la suspensión se han desarrollado15, esas bolsas de cultura son en forma de cuadrado, lo que impide la cultura efectivamente conseguir mezcla en agitación orbital. La bolsa en este estudio tiene una novela redonda de forma conveniente para agitación orbital para producir agregados con un tamaño homogéneo. Esta característica de los vasos es importante para el control de las condiciones y la alta reproducibilidad de células de producción en masa. La posible aplicación de la nave en forma de O es generalizada. Puede ser utilizado al producir proteínas recombinantes de las células y para la medicina regenerativa con células madre.
En conclusión, hemos desarrollado una novela en forma de O bolsa adecuada para la producción de agregados de células uniformes con una cultura de agitación orbital. La bolsa de muestra posibilidades para diversas aplicaciones biomédicas tales como en medicina regenerativa.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación es apoyada por una colaboración con Yoshida de Takao KYŌHEI, CO., Ltd. de KYŌHEI, CO., Ltd. proporciona la idea de la bolsa formada O de la cultura. Takamasa Sato de KYŌHEI, CO., Ltd. apoyó esta investigación en términos de una simulación computacional para el desarrollo de la bolsa formada O de la cultura. Nos gustaría apreciar afiliación actual del autor correspondiente, la Universidad de Osaka, para lo que nos permite trabajar en la publicación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
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